南方农业学报

作者：张娜, 孙春梅, 冉璜馨, 常健红, 姚爱芹, 杨亦晨, 唐军荣, 韩庆莉,

关键词：齿瓣石斛, 黄酮醇合成酶（FLS）, 体外酶活, 分子对接,

【目的】 克隆齿瓣石斛黄酮醇合成酶（FLS）基因（DdFLSs），并进行体外功能分析，为深入探究齿瓣石斛黄酮类化合物合成调控机制提供理论依据。【方法】 基于齿瓣石斛叶片转录组测序数据，筛选并克隆DdFLSs候选基因，并对其进行生物信息学分析及原核系统表达，通过体外酶活验证DdFLSs的催化活性。【结果】 成功克隆出2个DdFLSs基因，分别命名为DdFLS1和DdFLS2。DdFLS1和DdFLS2基因的开放阅读框（ORF）长度均为1002 bp，编码333个氨基酸残基，相对分子质量分别为37.54和37.71 kD，均为不稳定的亲水性蛋白，均含有典型的2OG-Fe（II）-Oxy、PcbC、PLN02704保守结构域，属于Fe2+和2-酮戊二酸依赖型双加氧酶（2-ODD）超家族，二者的二级结构中均以α-螺旋、无规则卷曲占比较高，三级结构与模板B0FYE8.1.A Flavonol synthase的一致性均为70%。DdFLS1和DdFLS2与拟南芥、洋葱、铁皮石斛的FLS氨基酸序列相似性为75.98%~98.70%，其中，与同为石斛属的铁皮石斛FLS氨基酸序列相似性最高，且在系统发育树中处在同一小分支，表明二者亲缘关系最近。在16 ℃条件下用0.5 mmol/L IPTG诱导14 h后，DdFLS1和DdFLS2蛋白在原核表达系统中成功表达，用250 mmol/L咪唑洗脱缓冲液纯化时效果最佳。体外酶活验证显示，DdFLS1和DdFLS2蛋白并未表现出典型的FLS活性，即不能催化二氢山柰酚、二氢槲皮素、二氢杨梅素生成相应的黄酮醇，但二者能催化柚皮素生成二氢山柰酚，表明其具有黄烷酮3-羟化酶（F3H）的活性。【结论】 从齿瓣石斛克隆获得的2个DdFLSs基因，其编码蛋白无FLS活性，但具有F3H活性，可能是由于DdFLS1和DdFLS2蛋白2个关键位点均发生了突变，导致DdFLS1和DdFLS2活性发生转变。

来源：2026年第3期

《南方农业学报》期刊编辑部

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