南方农业学报杂志

南方农业学报杂志2023年第8期

• 深耕对烤烟产量产值及根际土壤微环境的影响

  张汴泓, 雷涵, 李日坤, 杨铭榆, 潘睿欣, 潘美清, 王成己, 唐莉娜, 黄锦文,

  【目的】探讨深耕栽培对烤烟产量产值及根际土壤特性和微生态系统的影响,以期为福建烟区构建合理耕层及建立烤烟优质高效栽培体系提供科学依据。【方法】以福建烟区自然耕深15 cm+中耕培土为对照(CK),设耕深20 cm+中耕培土(D1)、耕深25 cm+中耕培土(D2)和耕深25 cm+免中耕培土(D3)3个深耕处理,对比分析各处理的烤烟产量产值及土壤理化性质差异,并采用Illumina MiSeq高通量测序技术,系统分析深耕处理下根际细菌结构差异与功能多样性变化,运用Spearman相关系数与随机森林模型评估根际细菌群落与土壤养分及烤烟产量的相关性。【结果】深耕可显著提高烤烟产量产值(P<0.05,下同),以D2处理增产增效效果最好,但与D3处理间差异不显著(P>0.05,下同)。土壤性质方面,各深耕处理均可较CK显著改善土壤总孔隙度和毛管孔隙度;土壤碱解氮含量及脲酶、蔗糖酶和过氧化氢酶活性随着耕深的加深而提高。适当深耕可显著提高细菌α多样性;深耕处理下绿弯菌门(Chloroflexi)与伯克氏菌属(Burkholderia)相对丰度显著上升,而罗河杆菌属(Rhodanobacter)相对丰度显著下降。Bugbase表型预测结果表明,深耕处理可显著提高根际土壤好氧菌与革兰氏阴性菌丰度,D2和D3处理较CK和D1处理显著提高氧化胁迫耐受菌相对丰度。FAPROTAX功能预测结果显示,各深耕处理均可较CK显著提升固氮作用(Nitrogen fixation)、纤维素分解(Cellulolsis)等养分循环方面功能相对丰度。随机森林模型预测结果显示,固氮作用是影响烤烟产量形成的最主要因素。【结论】在福建烟区耕层普遍变浅现状下,适度深耕(25 cm)对改善烤烟根际微生态环境有积极作用,但适度深耕下烤烟旺长前是否进行中耕培土对烤烟产量产值无显著影响。

• 不同氮素形态配比对烟草青枯病发生及土壤细菌群落的影响

  宝童曦, 高正锋, 徐丝, 李先伟, 黄荣斌, 邹应啟, 周庆兰, 吕敏, 白羽祥, 吕芬,

  【目的】探究不同氮素形态配比与烟草青枯病发生、烟株根际土壤理化性质及土壤细菌群落之间的关系,筛选出关键微生物及土壤因子,为烟草青枯病防治和氮肥合理施用提供理论依据。【方法】以往年烟草青枯病严重发生地块为试验地,设计5个不同氮素形态配比及常规对照(CK)处理,调查不同硝态氮与铵态氮配比处理的烟草青枯病发生情况;收集不同硝态氮与铵态氮配比处理烟株的根际土壤,测定土壤理化性质;采用16S rDNA测序技术,探究不同硝态氮与铵态氮配比下烟草青枯病发生及根际土壤细菌群落结构的差异。【结果】与CK处理相比,硝态氮与铵态氮以1∶1配合施用时有效降低了烟草青枯病的发病率和病情指数,同时提高了烟叶的SPAD值,而当硝态氮与铵态氮以7∶3配合施用时,土壤细菌群落的丰富度和均匀度增加。主坐标分析(PCoA)结果表明,不同氮素形态配比对土壤细菌群落有显著影响(P<0.05,下同)。在门分类水平上,变形菌门(Proteobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria)是较占优势的土壤细菌门;在属分类水平上,芽孢杆菌属(Bacillus)是最优势的土壤细菌属,其次是鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、Candidatus_Udaeobacter、苔藓杆菌属(Bryobacter)和黄杆菌属(Flavobacterium)。冗余分析和Pearson分析结果表明,土壤有机质(SOM)、速效钾(AK)和硝态氮(NO-N)是影响土壤细菌群落发生变化的主要理化因子。【结论】不同氮素形态配比可影响烟草青枯病的发生以及土壤细菌群落的多样性和物种组成。硝态氮与铵态氮以1∶1配比为最优处理,可有效降低烟草青枯病的发病率和病情指数,提高土壤中芽孢杆菌属和黄杆菌属的相对丰度。适当增加硝态氮比例有利于土壤健康微生态的构建。

• 遮荫栽培条件下茄衣烟田微气候特征及其对烟株生长发育和烟叶质量的影响

  王硕立, 薛子钟, 丁松爽, 侯冰清, 赵曦, 刘冰洋, 时雅琪, 时向东,

  【目的】探究遮荫栽培条件下茄衣烟田微气候特征对烟株生长发育和发酵后烟叶质量的影响,以期为国产茄衣遮荫栽培提供理论依据。【方法】以雪茄烟品种云雪1号为试验材料,设透光率100%(CK)、75%(T1)和65%(T2)3个处理,分析不同处理下的烟田微气候特征及其对烟株农艺性状、生物量积累与分配及发酵后烟叶主要品质特征的影响。【结果】遮荫处理能降低烟田的气温、光照强度、昼夜温差及≥10℃有效积温,提高相对湿度。遮荫对烟株株高、茎围、最大叶面积、生物量积累等生长发育指标均有显著影响(P<0.05,下同)。其中,株高、最大叶面积、叶生物量均以T2处理最高,且在遮荫后40 d时增幅最大,而茎围则以CK最大。T2处理烟叶的叶片结构、油分、颜色均匀度、支脉粗细等外观质量指标得分最高,其拉力强度也显著高于其他处理。遮荫处理茄衣产量和茄衣产出率均显著高于CK,与CK相比,T1和T2处理茄衣产量分别显著增加5.87%和13.78%,茄衣产出率分别显著增加8.56%和18.56%。相关分析结果表明,遮荫条件下温度(积温、≥10℃有效积温和平均气温)的降低是烟株叶厚、茎围和根茎生物量积累减少的主要原因;平均光照强度降低和平均相对湿度增加是提升烟叶外观质量和物理特性的关键因素。【结论】遮荫能降低茄衣烟田的环境温度和光照强度,提高相对湿度,使烟株的形态发育和物质积累产生改变,从而提高茄衣产量和茄衣产出率,也使发酵后烟叶的外观和物理指标更符合工业使用。综合来看,在豫西南遮荫种植茄衣时以65%透光率较适宜。

• 基于气候条件的湖南雪茄烟叶种植区分类研究

  王会青, 彭曙光, 时向东, 刘勇军, 肖志鹏, 丁松爽,

  【目的】明确湖南雪茄烟叶种植区与国外优质雪茄烟叶产地的气候相似性,为湖南不同雪茄烟叶种植区的气候评价及雪茄烟叶种植类型选择提供参考依据。【方法】选取湖南8个雪茄烟叶种植区(长沙宁乡市、衡阳常宁市、永州双牌县、张家界永定区、张家界慈利县、张家界桑植县、郴州桂东县和怀化麻阳县),以移栽后第1~5个月的逐月气温、降水量、相对湿度、短波辐射净强度和日照时数为气候因子,分析各种植区与国外优质雪茄烟叶产地(古巴茄衣产地圣路易斯、古巴茄芯产地圣胡安马丁内斯、非古巴茄衣产地厄瓜多尔和非古巴茄芯产地多米尼加)的气候相似性,结合聚类分析和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)对种植区进行分类,并进一步明确各种植区的气候条件差异。【结果】湖南8个雪茄烟叶种植区的气候条件均与古巴茄衣产地中等相似,其中长沙宁乡市、张家界桑植县和郴州桂东县还与非古巴茄芯产地多米尼加中等相似;基于气候条件可将上述区域分为两大类:第Ⅰ类为茄衣生产潜力区,包括张家界慈利县、张家界永定区、怀化麻阳县、衡阳常宁市和永州双牌县5个种植区;第Ⅱ类为茄衣茄芯生产潜力区,包括长沙宁乡市、张家界桑植县和郴州桂东县3个种植区;OPLS-DA模型可成功区分Ⅰ类区和Ⅱ类区,说明两大类种植区的气候条件有明显区别;重要性排序(VIP)预测值分析结果显示,烟株移栽后第1、2、3和5个月的短波辐射净强度和第1、2和3个月的日照时数等7个气候指标为两大类种植区间的差异性指标(VIP>1.2);Ⅱ类区较高的短波辐射净强度和日照时数是其可进行茄芯烟叶生产的主要原因。【结论】湖南雪茄烟种植区可分为茄衣生产潜力区和茄衣茄芯生产潜力区,对种植区分类影响最大的气候因素是短波辐射净强度和日照时数。

• 不同pH和镉浓度对雪茄烟种子萌发和幼苗生长生理的影响

  贺远, 伍宗毅, 陈国瑀, 高华军, 李龙科, 刘海伟, 刘春奎, 陈耘丰,

  【目的】探讨不同p H和镉(Cd)浓度对雪茄烟种子萌发和幼苗生长生理的影响,以期为优质、安全的雪茄烟原料生产提供参考。【方法】采用水培试验,设不同pH(3、5、7、9和11)和不同Cd浓度(0、10、50和250µmol/L)处理;测定不同处理的种子萌发指标(发芽率和发芽势)、幼苗生长生理指标胚根长、胚芽长、干物质重、叶绿素含量、硝酸还原酶活力、丙二醛(MDA)含量、根系活力和幼苗各部位Cd含量。【结果】Cd浓度相同时,随着pH增加,雪茄烟种子的发芽率呈先升高后降低的变化趋势;相同pH条件下,添加Cd处理的雪茄烟种子发芽率随着Cd浓度的增加呈降低趋势;pH为7、Cd浓度为10µmol/L时,种子发芽势和发芽率最高。在相同pH条件下,雪茄烟幼苗胚根长随着Cd浓度的升高呈先增加后减小的变化趋势;pH为3和7时,幼苗胚芽长随着Cd浓度的升高逐渐减小,其他pH条件下幼苗胚芽长随着Cd浓度的升高先增加后减小;pH为9、Cd浓度为10µmol/L时,胚根长和胚芽长达最大值。除0µmol/L Cd处理外,雪茄烟幼苗的干物质重随着Cd浓度的升高而降低,随着pH的升高而先升高后降低。10~250µmol/L Cd处理下,雪茄烟幼苗根部、茎秆和叶片的Cd含量大多随着pH的升高逐渐降低,随着Cd浓度的增加而增加。烟草幼苗的叶绿素含量、硝酸还原酶活力、根系活力随着pH的升高呈先升高后降低的变化趋势,但随着添加Cd浓度的升高而降低。pH在5~11时,雪茄烟幼苗中MDA含量随着Cd浓度的增加而增加,10~250µmol/L Cd处理下,MDA含量随着pH升高呈升高—降低—升高的变化趋势,均在pH为7时达最小值。【结论】低浓度的Cd对雪茄烟种子萌发有促进作用,随着Cd浓度升高,雪茄烟幼苗生长生理受到抑制。pH变化会影响雪茄烟幼苗对重金属Cd的吸收积累,进而影响雪茄烟幼苗的正常生长和干物质积累,当pH为7时,10µmol/L Cd处理提高了雪茄烟幼苗的叶绿素含量、硝酸还原酶活力和根系活力,有利于幼苗生长。

• 抗烟草黑胫病菌生防细菌筛选、鉴定及体外拮抗机理初探

  付克剑, 崔永和, 黄智华, 张继来, 张立猛, 邓毅书, 张智浩, 聂强, 周洪印, 苏友波,

  【目的】从云南烟草黑胫病高发区烟草根际土壤分离对烟草黑胫病菌具有高效拮抗作用的菌株,明确拮抗菌株的分类地位,并进行体外拮抗机理初探,为烟草黑胫病的防治提供生防资源和参考依据。【方法】采用平板对峙法从烟草根际土壤中分离对烟草黑胫病菌具有拮抗作用的菌株,通过生理生化特性及16S rDNA序列分析对具有较强拮抗活性的菌株进行鉴定,并测定生防细菌在体外对烟草疫霉的生物防治活性及作用方式。【结果】从采集的烟草根际土壤样品中共分离出6株对烟草疫霉具有拮抗活性的细菌菌株,其中菌株CD-1表现出最强的拮抗活性,其抑菌带宽度达10.12 mm;根据生理生化特性和16S rDNA序列分析,将该菌株鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。菌株CD-1具有广谱抗真菌特性,其胞内和胞外均存在抗真菌物质,其中使用二氯甲烷作为细菌发酵液萃取剂所提取的抗真菌物质的抑制效果最好;在p H 6~8、温度40~80℃时表现出相对稳定的抑制活性;菌株CD-1在NB培养基中培养的上清液提取物和细胞提取物对烟草疫霉均表现出较强的抑制活性,其抑制率分别达76.91%和67.23%;菌株CD-1分泌的抗真菌物质能破坏烟草疫霉的孢子质膜,抑制孢子萌发,其中以抗真菌粗提取物0.4 mg/mL处理烟草疫霉孢子6 h后的孢子失膜率达53.62%,孢子萌发被完全抑制,同时检测到有明显的离子和核酸渗漏。【结论】地衣芽孢杆菌CD-1产生的代谢产物抗菌谱广,抑菌活性强,具有开发成生防菌剂的潜力。

• 烟草青枯病复配诱抗剂筛选及增效作用机制

  李洁, 李锡宏, 李伦安, 张艺千, 康佳, 黄俊斌, 郑露, 黎妍妍,

  【目的】筛选最佳类黄酮复配诱抗剂,明确类黄酮复配诱抗剂在防治烟草青枯病中的增效作用机制,为提高烟草青枯病的防控水平及开发新型复配诱抗剂提供科学依据。【方法】以类黄酮(黄酮和橙皮素)为研究对象,将浓度为200 mg/L的8种助剂分别与1 mmol/L黄酮和1 mmol/L橙皮素进行复配,筛选可以与黄酮和橙皮素进行复配的助剂;通过室内盆栽试验测定复配诱抗剂在防控烟草青枯病中的作用,筛选获得最佳复配诱抗剂。进一步评价最佳复配诱抗剂对烟草青枯病的防治作用,并测定烟株过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性,采用实时荧光定量PCR技术测定烟株抗病相关基因NtPR1a、NtPAL、NtNPR1、NtHIN1和NtEFE26的表达水平,明确复配诱抗剂在防控烟草青枯病中的作用机制。【结果】8种助剂中,二氧化硅和卵磷脂可提升黄酮及橙皮素对烟草抗青枯病的防效,适宜浓度分别为50和100 mg/L。与类黄酮单剂相比,复配诱抗剂(1 mmol/L黄酮+50 mg/L二氧化硅、1 mmol/L黄酮+100 mg/L卵磷脂、1 mmol/L橙皮素+50 mg/L二氧化硅和1 mmol/L橙皮素+100 mg/L卵磷脂)对烟草青枯病的防效提升36.88%~67.21%。复配诱抗剂可明显提高烟草叶片中POD、PPO和PAL等防御酶活性,与黄酮单剂相比,施用黄酮+卵磷脂后烟草叶片中POD、PPO、PAL活性分别提高19.47%~37.95%、25.89%~66.91%和22.98%~254.83%;与橙皮素单剂相比,施用橙皮素+卵磷脂后烟草叶片中POD、PPO、PAL活性分别提高3.69%~114.37%、12.27%~58.04%和28.12%~104.39%。复配诱抗剂处理后烟草抗病相关基因NtNPR1、NtPR1a和NtHIN1的相对表达量均显著高于单施黄酮、橙皮素及清水对照处理(P<0.05)。【结论】50 mg/L二氧化硅和100 mg/L卵磷脂可提升1 mmol/L黄酮及1 mmol/L橙皮素对烟草青枯病的防控效果,提高烟株防御酶活性以及抗病相关基因的表达,可用于新型复配诱抗剂的开发。

• 初烤烟叶干燥动力学与水分扩散特性分析

  陈家鼎, 李爱军, 耿宗泽, 张豹林, 李生栋, 任江皓, 魏硕, 王涛,

  【目的】探究初烤烟叶不同部位的干燥特性及水分扩散特性,为初烤烟叶热加工过程工艺优化及降低能源消耗提供理论依据。【方法】开展不同热风温度(25、35、45、55和65℃)条件下初烤烟叶的叶片和主脉干燥试验,分别研究其干燥动力学、相关干燥数学模型、水分扩散系数及干燥活化能,并考虑温度和含水率对水分扩散系数的影响,分析干燥过程初烤烟叶的水分扩散能力变化。【结果】初烤烟叶叶片和主脉的干燥速率均随温度的升高而增大,整体呈降速干燥趋势,同一温度下,叶片的干燥速率高于主脉;3个模型拟合结果显示,Page模型可较准确描述叶片和主脉的干燥动力学,决定系数(R2)均大于0.99000,均方根误差(RMSE)均小于0.03000;叶片和主脉的水分扩散系数分别为0.97×10-12~14.92×10-12和51.72×10-12~1386.53×10-12m2/s、干燥活化能分别为58.43和69.50 kJ/mol;叶片和主脉的水分扩散系数均随温度和含水率的升高而增大,分别构建了叶片D=2.18×10-10exp(-202.3/T+2.701/M)和主脉D=4.60×10-8exp(-245.2/T+1.842/M)的水分扩散系数(D)与温度(T)及含水率(M)的关系模型,准确描述了干燥过程初烤烟叶的水分扩散能力变化。【结论】初烤烟叶叶片的水分扩散能力远小于主脉,建立的干燥模型和水分扩散系数模型可为烟叶复烤加工环节的过程控制和数值模拟提供支撑。

• 四川烤烟游离氨基酸含量特征及其与烟叶品质关联分析

  韶济民, 张海燕, 李奇, 别瑞, 庄志麟, 邱军, 靳冬梅, 曹建敏,

  【目的】探究四川烤烟游离氨基酸与烟叶感官和外观品质的关联性,确定影响烟叶品质的关键氨基酸指标,为四川优质烟叶的定向调控及品质提升提供理论参考。【方法】采集四川省5个烤烟主产区(凉山、攀枝花、宜宾、泸州和广元)188份烟叶样品,进行外观质量和感官质量评价,测定游离氨基酸含量,采用Pearson相关分析及曼特尔(Mantel)检验系统分析游离氨基酸含量和各类氨基酸占比与感官、外观质量等品质指标的相互关系,筛选影响四川烟叶品质的关键氨基酸指标,并分析5个产区关键氨基酸指标的含量分布特征。【结果】四川烤烟共检出17种游离氨基酸,总量均值为14.2 mg/g,其中脯氨酸含量最高,占氨基酸总量的83.4%,异亮氨酸含量最低,均值仅为7.6μg/g;17种游离氨基酸含量表现为上部叶>中部叶,且部位间差异均达极显著水平(P<0.01,下同)。相关分析结果表明,17种游离氨基酸指标间主要为正相关,异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、碱性氨基酸占比、芳香族氨基酸占比、含羟基类氨基酸占比和酰胺类氨基酸占比与烟叶品质呈负相关,亚氨基酸占比与烟叶品质呈正相关;Mantel检验进一步揭示碱性氨基酸占比、组氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸是影响四川烤烟品质的关键氨基酸指标。四川省5个烤烟主产区中凉山烟叶的关键氨基酸指标含量大多处于中等或偏低水平,广元烟叶的大多数关键氨基酸指标含量偏高。【结论】四川初烤烟叶游离氨基酸指标间均存在中等程度或高度相关性,大部分游离氨基酸指标与烟叶品质呈负相关。生产中适当控制游离氨基酸含量,提高亚氨基酸占比,有利于四川烤烟品质提升。

• 基于综合赋权法的河南不同油分档次烤烟烟叶质量评价

  付光明, 高子婷, 贾保顺, 李致新, 韦凤杰, 张士怡, 杨晓朋, 来苗, 常剑波, 姬小明,

  【目的】基于不同油分档次烟叶化学成分和感官质量的差异,构建综合赋权评价体系,建立不同油分档次烟叶的质量评价方法,对不同油分烟叶的可用性进行评价,为高油分优质烟叶的质量鉴评及利用提供参考依据。【方法】以河南省三门峡市灵宝县全叶位覆盖的不同油分档次(少、稍有、有和多)132份云烟87烟叶样本的化学成分和感官质量指标为数据集,利用隶属度函数对化学成分指标和感官质量指标赋值,通过主成分赋权法、变异系数赋权法、主观赋权法和综合赋权法,对各指标重新赋权,从而评价不同油分烟叶的可用性。【结果】随烟叶油分档次由少到多,总氮含量、氯含量和氮碱比总体上呈降低趋势,少油分烟叶的总氮含量较其余油分档次烟叶高5.15%~46.41%;总糖、还原糖、总植物碱和钾含量呈升高趋势,多油分烟叶的总糖和还原糖含量较其余油分档次烟叶分别高12.20%~28.96%和10.09%~30.64%;除总植物碱和氮碱比指标外,烟叶油分与其余7项化学指标均呈显著(P<0.05)或极显著(P<0.01,下同)相关。随烟叶油分档次由少到多,感官质量各项指标得分及总分均呈升高趋势,烟叶油分与各感官质量指标得分均呈极显著正相关。综合赋权法相较于单一赋权法,提高了不同油分档次烟叶可用性指数的区分度,随烟叶油分档次降低,可用性指数明显下降,多油分烟叶可用性指数最高(0.644~0.794)。相关分析结果表明,综合赋权法与各单一赋权法结果强相关。【结论】基于烟叶的化学成分指标和感官质量指标构建的综合赋权法,可对不同油分档次烟叶可用性进行科学有效地评价,为后续高油分烟叶的生产鉴评提供一种质量评价方法。

• 广西烟区烟蚜为害烟草的经济损失及防治指标

  官涵杰, 杨茂发, 李帅, 王五权, 于晓飞,

  【目的】明确广西烟区烟蚜的田间防治指标,为广西烟区烟蚜的精准防控提供科学依据。【方法】采用田间笼罩接虫法,烟蚜接虫数量设0(CK)、10、50、100和200头/株5个处理,每处理40株烟,研究烟蚜发生量与烟株生长发育及烤后烟叶品质、烟叶经济损失、烟叶产量损失间的关系,获得其经济阈值和生态经济阈值。【结果】接虫后,烟株的株高、叶片数、最大叶宽和最大叶面积均随着接虫数量的增加而降低,接虫数量与烟株农艺性状各指标呈负相关。烟蚜为害会导致烤后烟叶总糖、还原糖、糖碱比和氮碱比显著上升(P<0.05,下同),淀粉、总氮、粗蛋白、烟碱和钾含量显著下降,两糖比无显著变化(P>0.05);接虫数量与总糖、还原糖、两糖比、氮碱比和糖碱比呈正相关,其中与氮碱比和糖碱比达极显著水平(P<0.01,下同),与总氮和烟碱呈极显著负相关;烟蚜为害并不会显著降低烤后烟叶化学成分综合协调性指标。烟叶的产量和产值均随着烟蚜接虫数量的增加而逐渐降低,接虫数量为10、50、100和200头/株时,其产量分别为2085.30、2023.20、1972.80和1916.10 kg/ha,产量损失率分别为1.18%、4.21%、6.48%和9.11%,产值分别为57623.36、54288.23、51792.62和48987.77元/ha,经济损失率分别为4.63%、10.27%、14.35%和18.83%。烟蚜的经济阈值为11.99~65.50头/株,生态经济阈值为23.41~90.30头/株。【结论】随着烟蚜为害程度的加重,烟株各农艺性状指标呈下降趋势,烟株长势逐渐变差,烤后烟叶化学成分综合协调性指标降低,烟叶产量、产值、上中等烟叶比例和均价逐渐下降,产量损失率和经济损失率逐渐上升。建议广西烟区烟蚜的田间防治指标为48.76头/株。

• 甘蔗分子伴侣ShDnaJ基因克隆及在甘蔗线条花叶病毒胁迫下的表达分析

  冯小艳, 王文治, 王俊刚, 沈林波, 赵婷婷, 冯翠莲, 张树珍,

  【目的】克隆甘蔗分子伴侣基因ShDnaJ,并分析其在甘蔗线条花叶病毒(SCSMV)胁迫下的表达模式,为探究ShDnaJ基因在甘蔗应答SCSMV侵染过程中的功能和作用机制提供理论参考。【方法】通过同源克隆技术克隆ShDnaJ基因完整开放阅读框(ORF)序列,利用生物信息学软件对其进行分析,再利用绿色荧光蛋白(GFP)融合表达法分析ShDnaJ蛋白的亚细胞定位,采用实时荧光定量PCR检测ShDnaJ基因在甘蔗不同组织及在SCSMV胁迫下的表达水平。【结果】ShDnaJ基因ORF全长1260 bp,编码419个氨基酸残基,蛋白分子量为45682.47 Da,理论等电点(pI)为8.78,属于稳定的亲水蛋白,含有DnaJ结构域,属于DnaJ超家族成员,定位于内质网。ShDnaJ蛋白的二级结构由113个α-螺旋、31个β-转角、78个延伸链和197个无规则卷曲组成。ShDnaJ蛋白与高粱SbDnaJ蛋白的氨基酸序列相似性最高,为96.93%,说明两者亲缘关系最近。ShDnaJ基因在甘蔗根、茎和叶中均有表达,且根和茎中的相对表达量显著高于叶中(P<0.05,下同),但未成熟茎Sh DnaJ基因的相对表达量高于成熟茎;成熟叶ShDnaJ基因的相对表达量高于未成熟叶。随着处理时间的推移,SCSMV胁迫组和对照组(磷酸缓冲液处理)中ShDnaJ基因的相对表达量整体呈下降趋势,但SCSMV接种后不同时间点ShDnaJ基因的相对表达量均显著高于对照组。【结论】ShDnaJ基因具有组织表达特异性,且组织的成熟程度会影响其表达水平。SCSMV胁迫下该基因表达上调,推测该基因参与调控甘蔗植株对SCSMV的抗性。

• 桑树热激转录因子（Hsf）基因家族克隆及MnHsfA1基因表达模式分析

  刘丹, 邱长玉, 韦伟, 陆晓媚, 黄胜, 曾燕蓉, 朱光书, 张朝华, 何骥, 林强,

  【目的】克隆桑树热激转录因子(Hsf)基因家族成员,并分析MnHsfA1基因表达模式,为深入研究该家族在桑树热应激响应中的调控机制及桑树育种提供理论参考。【方法】以川桑幼苗为试验材料,克隆其MnHsfs基因,通过多序列比对、构建系统发育进化树和MEME保守基序在线预测分析,对MnHsfs蛋白的理化性质、保守结构域、信号肽、跨膜结构域、亚细胞定位和启动子顺式作用元件进行预测,利用实时荧光定量PCR检测MnHsfA1基因在高温和干旱胁迫处理下的表达模式。【结果】从桑树中克隆到14个MnHsfs基因的全长编码区(CDS)序列,分别为MnHsfA4a、MnHsfA4b、MnHsfA2、MnHsfA5、MnHsfA6b-1、MnHsfA6b-2、MnHsfB4-2、MnHsfA8、MnHsfB3、MnHsfB2b、MnHsfC1、MnHsfB2a、MnHsfB4-1和MnHsfA1,长度分别为1239、1278、1404、1431、1101、1140、1185、1197、711、996、1029、936、900和1437 bp,分别编码412、425、467、476、366、379、394、398、236、331、342、312、299和478个氨基酸残基,大部分MnHsfs蛋白是一个亲水、不稳定的酸性蛋白。MnHsfs蛋白包括结合功能域(DBD)、寡聚化功能域(OD)、AHA和KLFGV等结构域,可分为A、B和C类。MnHsfA1与苹果、菠菜和拟南芥的HsfA1相似性最高;与对照相比,MnHsfA1基因相对表达量在高温和干旱胁迫处理下均显著上调(P<0.05)。【结论】MnHsfs基因具有较高的遗传保守性,高温和干旱胁迫诱导MnHsfA1基因高表达,且MnHsfA1基因的启动子顺式作用元件中含有脱落酸、茉莉酸甲酯、赤霉素等激素响应元件以及与各种非生物胁迫相关的转录因子,推测其同时调节多种非生物胁迫。

• 高产小粒咖啡叶绿体基因组密码子偏好性分析

  李亚麒, 严炜, 娄予强, 黄家雄, 胡发广, 付兴飞, 李亚男, 程金焕,

  【目的】分析高产小粒咖啡叶绿体基因组密码子的使用模式及其偏好性影响因素,确定合适的异源表达宿主,为探究咖啡的系统进化分析及基因功能验证特别是异源表达提供参考依据。【方法】从GenBank数据库检索下载高产小粒咖啡(MK353209)的完整叶绿体基因组序列,从中选择长度大于300 bp,以ATG开始,TAG、TAA和TGA结尾,内部不存在终止密码子及重复序列的51条编码区序列(CDS),运用EMBOSS在线网站和CodonW 1.4.2等分析软件,系统分析高产小粒咖啡基因组密码子使用特征及其影响因素,并与模式生物的密码子使用频率比较。【结果】高产小粒咖啡基因组的密码子第1位(GC1)、第2位(GC2)和第3位(GC3)的GC含量和3个位置的平均GC含量(GC)均未超过50.00%,30个RSCU>1.00的密码子中,以A/T结尾的密码子占比96.67%,以G/C结尾的密码子占比3.33%,表明高产小粒咖啡叶绿体基因组倾向于使用A/T结尾的密码子。有效密码子数(ENC)、密码子适应指数(CAI)、最优密码子使用频率(Fop)的平均值分别为46.97、0.167和0.353,暗示高产小粒咖啡叶绿体基因密码子偏好性较弱。20个高频密码子分别为GCT、TGT、GAT、GAA、TTT、GGA、CAT、ATT、AAA、TTA、AAT、CCT、CAA、AGA、TCT、ACT、GTA、GTT、TAT和TAA。中性绘图、ENC-plot、PR2-plot和对应分析结果显示,密码子的偏好性受到自然选择、突变等因素的共同影响,其中自然选择起决定作用。密码子使用频率比较结果显示,与拟南芥、烟草、大肠杆菌和酿酒酵母密码子使用频率相比,高产小粒咖啡分别有23.44%、15.63%、40.63%和15.63%的密码子使用模式差异较大。最终确定了21个最优密码子,其中57.14%的密码子以T结尾,38.10%的密码子以A结尾,4.76%的密码子以G结尾。【结论】高产小粒咖啡叶绿体基因组密码子的偏好性较弱,仅对A/T结尾的密码子呈偏好性,其受到自然选择、突变、基因表达水平、基因长度等多种因素的共同影响。酿酒酵母和烟草更适合作为高产小粒咖啡基因的异源表达受体系统。

• 基于转录组测序分析阿氏芽孢杆菌R60对玉米抗旱性的影响

  舒健虹, 王子苑, 曾庆飞, 李小冬, 陈才俊, 王小利,

  【目的】分析干旱胁迫下阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)R60菌株对玉米耐旱性的影响,为抗旱性生物菌肥挖掘及玉米抗逆性提高提供理论参考。【方法】利用转录组测序技术,比较分析干旱胁迫下玉米根系接种阿氏芽孢杆菌R60菌株后的转录水平变化,以玉米根部注入灭菌的蒸馏水为对照,挖掘玉米的关键差异表达基因(DEGs),对其进行GO功能注释及KEGG信号通路富集分析。【结果】处理组和对照组共检测出1524个DEGs,与对照组相比,处理组有421个DEGs表达上调,有1103个DEGs表达下调。421个上调表达的DEGs共注释到26个GO条目上,包括13个生物学过程条目(细胞途径、代谢途径、刺激响应和生物调节等)、3个细胞成分条目(细胞结构体、细胞内和蛋白复合体)和10个分子功能条目(结合、催化活性和转录调控活性等)。表达下调程度排名前20的DEGs主要注释到5个生物学过程条目(细胞途径、生物调节和刺激响应等)、2个细胞成分条目(细胞结构体和细胞内)和4个分子功能条目(结合、转录调控活性等)。DEGs主要富集在RNA运输、m RNA通路、植物激素信号转导、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路及植物—病原互作等5条信号通路中。与对照组相比,处理组植物激素信号转导途径中,茉莉酸(JA)信号通路中的负调控茉莉酸ZIM结构域蛋白(JAZ)和下游的MYC2家族转录因子、赤霉素(GA)信号通路中的GA受体1(GID1)和负调控抑制蛋白(DELLA)、脱落酸(ABA)信号通路中的蛋白磷酸酶(PP2C)及乙烯信号通路中的乙烯受体转录因子1(ERF1)等编码基因表达下调;MAPK信号通路中,MAP激酶底物1(MKS1)和丝裂原活化蛋白激酶(MPK3、MKK9和MAPKKK18)等编码基因表达下调。此外,钙调节蛋白(CALM)和钙结合蛋白(CML)基因下调表达,而E3泛素连接酶(RHF、HOS1和BRE1)、磷酸核糖焦磷酸激酶(PRPS)和UDP葡萄糖醛酸酯4异构酶(GAE4)等编码基因表达上调。实时荧光定量PCR分析结果与转录组数据基本一致。【结论】阿氏芽孢杆菌R60促生菌可上调玉米植株根系中RHF、HOS1、BRE1、GAE4和PRPS等基因表达,但下调ERF1、DELLA和PP2C等基因表达,从而激活多个信号转导途径增强植株对干旱胁迫的耐受能力。

• 大蕉枯萎病菌二重PCR分子快速检测技术的建立

  曾莉莎, 王芳, 周海琪, 伍泽星, 赖永超, 傅长根, 吕顺, 梁少丽, 刘丽琴,

  【目的】基于大蕉枯萎病菌2个不同分化谱系特有的基因序列,建立大蕉枯萎病菌的二重PCR分子快速检测技术,为该病害预测及有效防控提供理论依据。【方法】基于大蕉枯萎病菌特有的r DNA基因间隔区(IGS)序列设计得到多对PCR引物,分别以广东3个粉蕉枯萎病菌株和8个大蕉枯萎病菌株、2个广西和海南的粉蕉枯萎病菌株、5个其他尖孢镰孢菌菌株和5个外围菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增,基于扩增结果从中筛选出大蕉枯萎病菌特异性引物,对其特异性和灵敏度进行检测,并确定二重PCR检测体系的含菌量检测下限。【结果】基于大蕉枯萎病菌特有的基因序列设计得到多对PCR引物,经筛选验证获得2对可用于检测大蕉枯萎病菌2个不同谱系(LineageⅠ和Ⅱ)的特异性引物,可直接应用于大蕉种植土壤和植株中的大蕉枯萎病菌检测,扩增片段分别为755和590 bp。当扩增条带为755 bp时,表明样本中含有大蕉枯萎病菌;当扩增条带为590 bp时,表明样本中含有粉蕉或大蕉枯萎病菌。建立的二重PCR检测体系检测大蕉枯萎病菌菌丝的灵敏度可达0.4μg,检测土壤的含菌量下限为每克土壤40个病原菌孢子。【结论】建立的二重PCR检测技术实现一次PCR反应同时检测并区分大蕉枯萎病菌2个谱系及广东地区的粉蕉枯萎病菌优势菌群,可用于无病大蕉和粉蕉种苗及种植土壤的检测与筛选。

• 纳米钾肥对桃幼苗生长和桃树叶片生理特性的影响

  李曼, 张东梅, 黄雪, 刘军伟, 朱凯杰, 李国怀,

  【目的】探究新型肥料纳米钾肥对桃幼苗生长和成年桃树叶片生理特性等的影响,为纳米肥料在桃树栽培上的应用提供理论指导。【方法】以毛桃幼苗和春美成年桃树为试材,比较纳米钾肥与3种传统肥料(硫酸钾、水溶肥和复合肥)对幼苗生物量、根系形态、光合性能及成年树叶片生理特性等的影响。【结果】在桃幼苗上,除纳米钾肥与硫酸钾肥在株高、地下部鲜重及根系形态指标上无显著差异(P>0.05,下同)外,纳米钾肥均能比其他处理显著增加株高、茎粗、叶片数、叶表面积及地上、地下部干(鲜)重和根系各项形态指标(P<0.05,下同)。同时,纳米钾肥能显著提高桃幼苗叶片中叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量及光系统Ⅱ最大光能转换效率(Fv/Fm)。在成年桃树上,与硫酸钾肥相比,纳米钾肥显著提高叶片的总叶绿素、可溶性糖、匀浆蛋白和脯氨酸含量,增幅分别达30.2%、48.6%、40.4%和33.6%;同时显著提高桃果实单果重,增幅达17.5%。水溶肥和复合肥对成年桃树叶片和果实的影响与纳米钾肥的效果相当,无显著差异。【结论】综合形态和生理指标,相比传统钾肥,纳米钾肥可不同程度地促进桃幼苗地上部和地下部的生长,提高幼年和成年桃树叶片叶绿素含量和光合性能,促进树体营养生长和果实生长,未来有望作为一种新型肥料在桃树实际生产中推广应用。

• 杂草管理方式对李园及其邻近天然林土壤真菌生态功能的影响

  罗昌国, 袁启凤, 陈守一, 田晓慧,

  【目的】探索李园杂草管理对土壤真菌多样性的影响,为土壤健康管理提供参考。【方法】以贵州省安顺市紫云县自然生草、人工生草、除草剂除草李园及邻近天然槲栎次生林的土壤为研究对象,提取土壤真菌DNA,对其ITS基因进行扩增和高通量测序,分析真菌种类的构成、相对丰度、多样性、生态功能类别等。【结果】不同杂草管理李园和天然林土壤的可操作分类单元(OTU)在420~1039个,真菌种类共计14门、51纲、127目、260科、492属,天然槲栎次生林土壤的OTU数量不到李园土壤的一半。4个处理土壤均主要以担子菌门(Basidiomycota)和子囊菌门(Ascomycota)为主;与天然林相比,李园土壤的担子菌门减少,子囊菌门增加,其中人工生草李园土壤的变化幅度较小、分别为36.79%和32.85%。天然林土壤的红菇属(Russula)占据绝对优势,相对丰度达54.44%。李园不同类型土壤的第一优势属为沙蜥属(Saitozyma),相对丰度为14.54%~38.11%,其中人工生草李园优势较为明显。此外,人工生草李园土壤中梳霉门(Kickxellomycota)和球囊菌门(Glomeromycota)的相对丰度较其他类型高。多样性分析结果显示,天然林与其他李园土壤间α多样性差异极显著(P<0.01,下同);不同杂草管理方式中,人工生草与自然生草的Simpson指数差异极显著。FUNGuild分析显示,天然林土壤以外生菌根真菌占绝对优势,而李园土壤以腐生真菌和未知真菌为主。【结论】李园人工生草(光叶紫花苕)有利于优势属沙蜥属及低丰度的梳霉门和球囊菌门菌群建立。不同杂草管理方式的李园仅有少量丛枝菌根真菌(球囊菌门),缺少占绝对优势的有益真菌,有益真菌在李树的运用上还有较大的提升空间。优势种类的结构导致不同处理真菌群在生态功能上存在差异。

• 68份澳洲坚果种质资源的表型分类研究

  林玉虹, 杨祥燕, 蔡元保, 潘如军, 崔明勇, 叶维雁, 曾黎明, 黄思婕, 李冰,

  【目的】对具有种植价值的68份澳洲坚果种质资源进行表型分类研究,为澳洲坚果种质资源的系统性分类与评价提供科学依据。【方法】根据《澳洲坚果种质资源描述规范和数据标准》和《澳洲坚果种质资源鉴定技术规范》等的鉴定评价方法,对来源于国内外68份澳洲坚果种质的64项表型性状(39项描述性状和25项数量性状)进行观测和描述,并基于此进行聚类分析和主成分分析。【结果】基于花表型性状的聚类分析,将68份种质分为长序多花型、中序多花杂交种和短序少花型3个类群。基于叶片表型性状的聚类分析,将68份种质分为大叶光壳种、中叶光壳种、小叶光壳种和大叶杂交种4个类群。基于果实表型性状的聚类分析,将68份种质分为大果光壳种、中果光壳种、小果光壳种和大果杂交种4个类群。基于其他类表型性状的聚类分析,将68份种质分为高产中晚熟型、中产早中熟型和低产早中熟型3个类群。综合聚类分析结果,将68份种质分为大叶大果多花型、中叶小果少花型、小叶中果少花型和大叶大果多花杂交种4个类群。综合64项表型性状的主成分分析及二维平面散点图,筛选出能系统评价68份种质表型分类的15个主要影响因子,包括带皮果单果鲜重、壳果单果鲜重/干重、叶片形状/叶形指数、坐果能力、成花能力、小花数量、小花颜色、成熟期特性、叶缘刺密度、壳果表面质地、嫩叶颜色、果仁重、叶面积、叶柄长度和叶序。【结论】基于花、叶片和果实等表型性状的聚类分析,支持现有的澳洲坚果分类体系;具有代表性的主要影响因子能科学、系统地评价澳洲坚果种质资源的表型分类。

• 8种海南热带水果的抗氧化活性比较分析

  吕金慧, 郑中兵, 吴涛, 孙娅辉, 陈萍,

  【目的】测定海南8种热带水果的抗氧化活性、总酚和总黄酮含量,比较8种水果抗氧化活性和抗氧化物质含量的差异,为人们食用热带水果提供一定的营养价值参考,也为抗氧化活性较强的热带水果相关产品的开发利用提供参考依据。【方法】以人心果、莲雾、山竹、榴莲、蛋黄果、西番莲、番荔枝和菠萝蜜8种热带水果为研究对象,利用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力法、铁离子抗氧化能力(FRAP)法和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)阳离子自由基清除能力法分别测定其抗氧化活性,采用福林酚(Folin-Ciocalteu)法测定总酚含量,AlCl3显色法测定总黄酮含量;并对3种抗氧化活性测定方法与2种抗氧化物质含量进行相关分析,对抗氧化活性测定结果进行优劣解距离(TOPSIS)法综合分析。【结果】利用DPPH法和FRAP法测得抗氧化活性最强的是蛋黄果(178.62和140.83μmol Trolox/g),最弱的是人心果;ABTS法测得抗氧化活性最强的是山竹(157.06μmol Trolox/g),最弱的是人心果;同时测得蛋黄果的总酚含量(3.80%)和总黄酮含量(7.60%)在8种水果中最高,而人心果的总酚含量(0.09%)最低,榴莲的总黄酮含量(1.07%)最低;3种测定方法与2种抗氧化物质的相关分析结果表明,DPPH法与总酚和总黄酮含量的相关系数达0.81以上,FRAP法与总酚和总黄酮含量的相关系数达0.90以上;利用TOPSIS法进行综合分析,抗氧化活性排序为蛋黄果>山竹>莲雾>西番莲>番荔枝>菠萝蜜>榴莲>人心果。【结论】8种热带水果均具有一定的抗氧化活性,以蛋黄果的抗氧化活性较强,人心果的抗氧化活性较弱。

• 新疆厚皮甜瓜种子萌发期的抗旱生理特性研究

  吴婷, 闫淼, 熊韬, 毛建才, 胡国智,

  【目的】比较新疆厚皮甜瓜(Cucumis melo L.)不同品种在种子萌发期的抗旱性差异,探究甜瓜种子在萌发期的抗旱生理机制,为优化甜瓜选育和栽培技术提供技术支持。【方法】以新疆厚皮甜瓜品种黄梦脆、黄皮9818、西州蜜17号、纳斯密和风味5号为供试材料,采用不同浓度聚乙二醇6000(PEG-6000)0%(对照)、5%、10%、15%、20%、25%模拟干旱胁迫,对5个甜瓜品种进行种子萌发期抗旱性试验,比较不同抗旱性的甜瓜种子在干旱胁迫下丙二醛(MDA)和脯氨酸(Pro)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性及内源激素含量的差异;设不同外源激素处理并测定种子萌发率。【结果】随着PEG-6000浓度的升高,各品种甜瓜种子发芽势、发芽率、相对发芽势、相对发芽率、胚轴长、胚根长和芽苗鲜重等萌发指标降低;隶属函数分析结果表明,甜瓜种子萌发期的抗旱能力排序为纳斯密>黄梦脆>黄皮9818>风味5号>西州蜜17号;干旱胁迫促进抗旱性最强的纳斯密和抗旱性最弱的西州蜜17号种子的MDA和Pro含量显著(P<0.05,下同)或极显著(P<0.01,下同)积累,并使SOD、POD和CAT活性显著或极显著增强,纳斯密中MDA含量增幅更低,而Pro含量及SOD、CAT和POD活性的增幅更高;干旱胁迫下,纳斯密和西州蜜17号种子的脱落酸(ABA)含量显著或极显著升高,茉莉酸(JA)含量显著降低;西州蜜17号的生长素(IAA)含量极显著下降,纳斯密的水杨酸(SA)含量极显著下降。纳斯密的IAA/ABA比西州蜜17号高20%,JA和SA含量分别比西州蜜17号高55%和68%;外源激素处理结果表明,干旱胁迫下,外源ABA处理降低甜瓜种子在不同时间的萌发率,低浓度SA(0.25 mmol/L)处理在12和24 h时分别使种子萌发率提高23%和27%,与低浓度茉莉酸甲酯(MeJA,0.025μmol/L)联合处理进一步提高种子萌发率,且适宜浓度MeJA缓解高浓度SA对种子萌发的抑制作用。【结论】纳斯密在种子萌发期抗旱性最强,西州蜜17号抗旱性最弱,干旱胁迫下纳斯密较西州蜜17号具有更高的抗氧化酶活性,其抗旱能力与IAA、ABA、SA和JA水平有关。

• 基于BSA-Seq的家蚕NC99R抗BmNPV分子标记鉴定

  唐亮, 蒋满贵, 唐名艳, 黄深惠, 陈小青, 董桂清, 王平阳, 潘志新,

  【目的】以BSA-Seq测序分析确定抗家蚕血液型脓病品种桂蚕N2抗性亲本NC99R的抗性SNP标记及抗性基因,为NC99R抗性基因鉴定打下基础,也为家蚕抗血液型脓病分子标记辅助育种提供标记资源。【方法】以抗病品种NC99R、感病品种芙蓉为亲本制备杂交F1、F2代及BC1遗传群体,通过添食核型多角体病毒(BmNPV)分析其遗传规律;在NC99R近等位基因系NC99R-NIL和芙蓉制备杂交的F2代群体中,设病毒浓度差异达4000倍的高浓度和低浓度添食组,在高浓度添食组挑选未发病个体用于构建极端抗性素材DNA混合池,在低浓度添食组挑选具有典型发病症状个体构建极端易感素材DNA混合池,利用二代测序技术完成抗性DNA混合池、易感DNA混合池及2个亲本基因组测序,并通过群体分离分析法(BSA)定位抗性连锁关联区域。【结果】NC99R对BmNPV表现出稳定的高抗性,基因组中携带有抗BmNPV基因,且由显著的抗性主效基因或紧密连锁基因共同调控。对极端抗性DNA混合池、极端易感DNA混合池及其亲本DNA进行全基因组测序分析,共获得19276670个SNP位点和4789615个InDel位点;基于ΔSNPindex的LOESS回归拟合分析,定位到2个与血液型脓病抗性关联的区域,分别为Chr.25:150-11069kb和Chr.27:8700-11009kb。同时将ΔSNP-index设定为≥0.8时,鉴定到3865个与抗性显著相关的SNP标记,其中,在25号染色体关联区域筛选出78个SNP标记,在27号染色体关联区域筛选出2694个SNP标记;再经氨基酸水平非同义突变筛查,定位到25号染色体Zinc carboxypeptidase基因和27号染色体Facilitated trehalose transporter Tret1基因。【结论】利用BSA-Seq在抗家蚕血液型脓病品种NC99R中发现与抗性相关的SNP标记资源有3865个,且初步鉴定到2个与抗BmNPV的相关基因(25号染色体Zinc carboxypeptidase基因和27号染色体Facilitated trehalose transporter Tret1基因),为家蚕抗血液型脓病分子标记辅助育种提供了标记资源。

• 基于基因组重测序的广西地方猪种遗传多样性和选择信号分析

  黎旺长, 刘玮玮, 龙佳佳, 杨小淦,

  【目的】基于全基因组重测序研究分析广西地方猪种与西方商业猪种的遗传结构,挖掘出广西地方猪种的选择基因,为我国地方猪种质资源的保存和利用打下基础。【方法】对广西地方猪种(巴马香猪、东山猪和陆川猪)和西方商业猪种(杜洛克猪、长白猪和大白猪)共60头猪个体进行基因组重测序分析,经质控后分别进行猪种亲缘关系、主成分层次、连锁不平衡衰减、群体遗传结构、系统发育进化树及群体遗传分化指数(Fst)等分析。【结果】西方商业猪种与广西地方猪种间的群体遗传关系较远,西方商业猪种群体聚集在一起,而广西地方猪种群体较分散;构建的系统发育进化树显示,6个猪种聚类成3个分支,其中,东山猪单独聚为一支,巴马香猪和陆川猪聚为一支,而杜洛克猪、大白猪和长白猪聚类在另一分支上。广西地方猪种组均被选择的位点共有641个受选择区域,最终定位注释到108个基因,其中Cenpp基因的受选择区域高达25个。这些基因显著注释到自然杀伤细胞分化正向调控、翻译抑制因子活性、mRNA调控元件结合、肽激素加工、正调控细胞迁移参与新生血管生成、电压门控离子通道活性及离子跨膜转运调控等GO功能条目;KEGG信号通路富集分析发现显著富集于内吞作用、cGMP-PKG信号、胆汁分泌、肌醇磷酸盐代谢和磷脂酰肌醇信号系统等通路上。【结论】广西地方猪种与西方商业猪种间存在明显差异,但广西地方猪种内部存在较高的近交现象,部分猪种可能受到西方商业猪种的影响,而导致其血统不纯。广西地方猪种共有641个受选择信号区域,定位注释到的108个基因主要参与离子跨膜转运、磷脂酰肌醇信号系统、正调控细胞迁移及新生血管生成等通路,其中Mrps27基因可能与广西地方猪种独特的生长发育有关。

• 禽传染性支气管炎病毒nsp4蛋白多克隆抗体制备及其生物学功能研究

  卢彦澎, 林丽婷, 任丽娜, 晋英浩, 张桃妮, 张愉, 韦兰萍, 吕迪, 磨美兰,

  【目的】筛选出禽传染性支气管炎病毒(IBV)非结构蛋白4(nsp4)抗原性较好的氨基酸区域并制备多克隆抗体,为进一步研究nsp4蛋白在IBV复制过程中的功能提供物质基础,也为研发IBV新型诊断试剂盒与疫苗打下基础。【方法】对IBV Beaudette株nsp4蛋白进行原核表达,以融合蛋白nsp4作为免疫原免疫健康日本大耳白兔和健康阴性鸡,制备相应的兔多克隆抗体和鸡多克隆抗体,并通过间接ELISA检测、Western blotting检测及IFA验证等对制备获得的多克隆抗体进行生物学功能研究。【结果】选取nsp4蛋白第408~514位氨基酸作为原核表达序列,成功构建了nsp4蛋白原核表达载体pCZN-1-HIS-nsp4和nsp4蛋白真核表达载体pVAX1-nsp4-HA。原核表达的融合蛋白nsp4为13.6 kD,与预期结果相符,能与IBV GX-YL5株和M41株全病毒阳性血清反应。制备的兔、鸡多克隆抗体血清效价分别为1∶128000和1∶6400,均能与融合蛋白nsp4和IBV全病毒反应,且与IBV GX-YL5株、Beaudette株和M41株感染鸡胚肾细胞(CEK)表达的nsp4蛋白反应,还能与转染状态及感染IBV Beaudette株的非洲绿猴肾细胞(Vero)表达nsp4蛋白反应。实时荧光定量PCR检测结果表明,经nsp4蛋白真核表达载体pVAX1-nsp4-HA转染后,Vero细胞的病毒载量呈逐渐上升趋势,即体外过表达nsp4蛋白能促进IBV的复制。【结论】制备获得的2种IBV nsp4多克隆抗体效价高、反应性良好、特异性强,可作为细胞定位及表达时相分析等蛋白特性研究的工具,用于解析nsp4蛋白在IBV增殖过程中的作用机制,也为其他冠状病毒nsp4蛋白的研究提供参考。

• 江西东方蜜蜂微卫星DNA的遗传多样性分析

  朱诗谣, 周姝婧, 朱翔杰, 徐新建, 苏显冰, 张芷宁, 姜荃耀, 周冰峰,

  【目的】明确江西省生境条件下东方蜜蜂遗传多样性水平及遗传分化规律,为促进江西省东方蜜蜂遗传资源的保护与利用,以及我国东方蜜蜂遗传资源的保护和合理布局提供理论依据。【方法】选用37个微卫星标记对江西省10个代表性样点共704群东方蜜蜂进行遗传特征、遗传多样性和遗传分化分析,利用Excel Microsatellite Toolkit 3.1计算观察杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、等位基因数(Na)和多态信息含量(PIC),采用PopGene 1.31计算有效等位基因数(Ne)和香农指数(I),通过GenAlEx 6.5和R 4.0.3分别进行主坐标分析(PCoA)和主成分判别分析(DAPC),运用Genepop on Web分析样点间的遗传分化指数(Fst),通过Fst=1/(1+4Nm)计算基因流(Nm),并以POPTREE2构建UPGMA聚类分析树。【结果】以37个微卫星标记从江西省10个样点704群东方蜜蜂中共检测出374个等位基因,其中PIC高于平均值的有21个微卫星标记(AP243、BI278、AP249、AT185、BI225、AC139、Ap313、AT004、AC045、K0715、AC011、AP189、BI314、Ap085、AT101、244T、Ac-1、Ac-2、Ac-5、Ac-26和Ac-35)。江西省10个样点东方蜜蜂群体的Na为5.2857~6.3125,平均值为5.8247;Ho为0.3951~0.4602,平均值为0.4197;He为0.4211~0.4676,平均值为0.4437;Ne为2.7991~3.2596,平均值为2.9205;PIC为0.3909~0.4366,平均值为0.4133;I为0.9090~1.0106,平均值为0.9542;10个东方蜜蜂样点间的近交系数(Fis)为-0.036~0.091,Fst为0.0059~0.0294,Nm为8.2534~42.1229。PcoA分析、DAPC分析及UPGMA聚类分析均显示,江西东方蜜蜂尚未发生种群遗传分化。【结论】江西东方蜜蜂遗传多样性处于全国中等水平,未发现江西东方蜜蜂发生种群遗传分化,且在东方蜜蜂遗传分化过程中基因交流的作用大于环境选择。

• Split-GFP双分子荧光互补技术在鸡MSTN基因RNAi检测中的应用

  杨磊, 朱正, 王博永, 梁谦学, 吴文德, 李恭贺, 郑喜邦,

  【目的】以Split-GFP双荧光互补技术检测鸡肌肉生长抑制素基因(MSTN)RNA干涉(RNAi)效果,并与其他常用检测方法比较,以验证Split-GFP双分子荧光互补技术在RNAi效果评估中的有效性和可行性。【方法】将合成的3个shRNA慢病毒载体(shRNA-a、shRNA-b和shRNA-c)分别转染稳定表达GFP11-MSTN融合蛋白的HEK293TGFP11-MSTN细胞,经实时荧光定量PCR筛选出最佳shRNA慢病毒载体并包装为慢病毒,然后以慢病毒感染HEK293TGFP11-MSTN细胞,采用潮霉素B筛选m Cherry阳性(mCherry+)细胞,再以实时荧光定量PCR和Western blotting检测RNAi效果;得到的m Cherry+细胞再转染pcDNA3.1(+)-GFP1-10质粒,通过荧光显微镜观察和流式细胞术评估RNAi效果。【结果】3个shRNA慢病毒载体对MSTN基因表达均有极显著的抑制作用(P<0.01,下同),其中又以Anti-MSTN shRNA-a慢病毒载体的干涉效果最佳。Anti-MSTN shRNA-a慢病毒感染HEK 293TGFP11-MSTN细胞的最适MOI=3,该条件下MSTN基因相对表达量及GFP11-MSTN融合蛋白表达量均受到抑制;得到的mCherry+细胞再转染pcDNA3.1(+)-GFP1-10质粒,荧光显微镜观察和流式细胞术检测结果表明,GFP+细胞数量明显减少,GFP+细胞百分率由31.1%降至11.5%。Split-GFP检测结果与实时荧光定量PCR及Western blotting检测结果相符,说明Anti-MSTN shRNA-a慢病毒能有效抑制GFP11-MSTN融合蛋白表达,发挥了RNAi作用。【结论】以Anti-MSTN shRNA-a慢病毒对MSTN基因的干涉效果最佳,其感染HEK 293TGFP11-MSTN细胞后MSTN基因表达极显著下调,且再转染pcDNA3.1(+)-GFP1-10质粒后细胞中的GFP+细胞百分率明显下降,与实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果相符,证实Slipt-GFP双分子荧光互补技术是一种可靠的可视化RNAi检测方法。

• 干扰FABP1基因对猪肌内脂肪沉积的影响

  熊讯, 李永, 阮涌, 许厚强,

  【目的】明确FABP1基因对猪肌内脂肪细胞脂肪酸和脂肪合成的影响,为进一步解析FABP1基因对猪肌内脂肪沉积和脂质代谢的调控作用提供依据。【方法】设计香苏杂交猪FABP1基因干扰载体的靶序列并合成,通过载体连接构建shRNA-FABP1干扰载体并测序验证;将正确的干扰靶序列转染猪肌内脂肪细胞,通过转染效果和实时荧光定量PCR筛选干扰效率最高的靶序列进行后续试验。采用TRIzol® Reagent总RNA提取试剂盒提取转染shRNA-FABP1干扰载体后的猪肌内脂肪细胞的总RNA,以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测脂肪沉积相关基因的相对表达量。运用气相色谱—质谱联用仪靶向检测猪肌内脂肪细胞内中长链脂肪酸(LCFA)的含量;采用GPO-PAP酶法检测猪肌内脂肪细胞甘油三酯(Triglyceride,TG)和胆固醇的含量。【结果】成功构建了shRNA-FABP1干扰载体并筛选出最佳干扰效率片段。FABP1基因干扰显著(P<0.05,下同)或极显著(P<0.01,下同)降低了脂肪沉积相关基因的相对表达量,包括LPL、FABP3、IGFBP4和OLR1。在FABP1基因干扰后的猪肌内脂肪细胞中共检测出38种脂肪酸,29种脂肪酸有差异;其中,FABP1基因干扰上调包括棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)和油酸(C18:1N9)等17种脂肪酸的比例,下调包括二十碳五烯(C20:5N3)、十七碳烯酸(C17:1N7)和十三烷酸(C13:0)等12种脂肪酸的比例。FABP1基因干扰显著或极显著降低了香苏杂交猪肌内脂肪细胞内TG和胆固醇的含量。【结论】干扰FABP1基因通过抑制与脂肪酸转运和TG合成相关基因的表达,从而改变脂肪酸的组成比例,降低TG和胆固醇的含量。

• 马链球菌兽疫亚种SclE蛋白原核表达及其免疫效力评价

  徐宇萌, 郭政, 李亚娟, 邓静飞, 何颍欣, 黄云飞, 付强,

  【目的】探究马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp. zooepidemicus,SEZ)表面蛋白SclE的免疫效力,为预防SEZ引起的链球菌病提供理论依据。【方法】采用PCR扩增SEZ的SclE基因,再将该片段克隆至原核表达pCold I载体上,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后以SDS-PAGE进行分析鉴定,获得的重组蛋白SclE(rSclE)(100μg/mL,0.5 m L)以腹腔注射形式免疫BALB/c小鼠(n=10,一免、二免的周期均为14 d)。一免、二免14 d后收集血清,通过ELISA和Western blotting检测抗体水平和特异性。二免后进行免疫保护试验,并对攻毒后小鼠的肝、脾、肺、肾进行细菌载量检测和病理组织学观察。【结果】SDS-PAGE检测到大小约为93 kD的蛋白表达,与SclE的理论分子量大小一致;Western blotting检测显示,表达所得重组蛋白能与SEZ阳性对照组(腹腔注射0.5 mL SEZ灭活疫苗)小鼠血清发生特异性结合,表明其具有良好的反应原性。ELISA检测显示,二免后小鼠血清中特异性抗体水平与一免后相比均有显著提升(P<0.05,下同),且可诱导小鼠产生高滴度的IgG,其中IgG1抗体水平(0.436±0.031)显著高于IgG2a(0.161±0.009),表明rSclE诱导的抗体亚型以IgG1为主;rSclE免疫小鼠可显著抑制SEZ在各脏器中的增殖能力,肝脏、脾脏出血及炎性细胞浸润的症状得到改善,肺脏和肾脏出血等病理损伤减轻;在小鼠免疫攻毒保护试验中保护70%小鼠免受致死剂量SEZ毒株的攻击。【结论】成功表达获得的r SclE能诱导小鼠产生SclE特异性抗体,且具有较好的保护效果,可作为一种SEZ潜在的疫苗候选抗原。

• 肉种鸡下笼后福利养殖模式下的生产性能和肠道组织形态差异分析

  王钱保, 黄华云, 李春苗, 黄正洋, 王志成, 赵振华,

  【目的】明确笼养肉种鸡下笼后不同饲养密度和活动空间对其生产性能和肠道组织形态的影响,为肉种鸡的合理淘汰提供科学有效方案。【方法】选取产蛋率和体重接近的60周龄待淘汰肉种鸡(L系母鸡),设平养组处理Ⅰ、处理Ⅱ和处理Ⅲ和笼养组(处理Ⅳ),各处理均为45只,3个重复;处理Ⅰ、处理Ⅱ和处理Ⅲ淘汰肉种鸡分别放养于密度为3.750、1.875和1.875只/m2的平养鸡舍内,其中处理Ⅲ设计栖架和沙浴福利养殖方式。饲养10周后测定、分析各处理淘汰肉种鸡的运动量、生产性能和肠道性能,筛选适宜淘汰肉种鸡的饲养密度和活动空间。【结果】平养组各处理淘汰肉种鸡的运动步数均显著高于笼养组(P<0.05,下同),但处理Ⅱ、处理Ⅲ和处理Ⅰ的运动步数依次显著递减;笼养组淘汰肉种鸡的产蛋率、日产蛋量和死淘率均显著高于平养组各处理,日采食量和料蛋比则相反;70周龄时处理Ⅲ淘汰肉种鸡的产蛋率、日采食量和日产蛋量显著高于处理Ⅰ,日采食量显著低于处理Ⅱ;笼养组淘汰肉种鸡的蛋壳强度和蛋黄重显著低于平养组各处理,处理Ⅰ淘汰肉种鸡的蛋壳强度显著低于处理Ⅲ;70周龄时,相比于笼养组,平养组各处理淘汰肉种鸡十二指肠、空肠和回肠的绒毛高度显著提升,隐窝深度降低,处理Ⅲ淘汰肉种鸡的十二指肠、空肠和回肠的绒毛高度均显著高于处理Ⅰ,但低于处理Ⅱ,隐窝深度则相反。【结论】淘汰肉种鸡下笼后生产性能和肠道组织形态均显著降低,但在饲养密度为1.875只/m2鸡舍内添加栖架和增设沙浴形成立体空间运动平台平养的福利饲养方式,可有效提升其部分生产性能,改善蛋壳强度和肠道功能,适宜在肉种鸡淘汰过程中参考应用。

• 丁酸梭菌与富硒酵母对蛋鸡生产性能及粪便菌群结构的影响

  陈孟姣, 王海波, 肖鹏, 何东贤, 莫红芳, 彭健波, 谢树桃, 周贞兵, 陆有飞, 白琳,

  【目的】探究混合饲喂丁酸梭菌(Clostridium butyricum)和富硒酵母对蛋鸡生产性能和粪便菌群结构的影响,为提升蛋鸡生产性能和经济价值提供参考依据。【方法】以海兰褐蛋鸡为试验动物,对照组(CK)饲喂基础日粮,试验组在基础日粮中添加丁酸梭菌类和富硒酵母(T1,添加1.0 g/kg丁酸梭菌和0.2 mg/kg富硒酵母;T2,添加2.0 g/kg丁酸梭菌和0.2 mg/kg富硒酵母;T3,添加3.0 g/kg丁酸梭菌和0.2 mg/kg富硒酵母)。预试期7 d,正试期28 d,期间测定蛋鸡的产蛋率、平均日采食量、平均蛋重、料蛋比和死淘率,试验结束时测定蛋形指数、蛋壳厚度、蛋黄颜色、蛋白高度、哈氏单位和鸡蛋硒含量,并收集各组蛋鸡粪便,通过生物信息学方法分析其菌群结构。【结果】在生产性能方面,与CK相比,T1的产蛋率显著提高(P<0.05,下同),平均蛋重无显著差异(P>0.05,下同),平均日采食量和料蛋比显著降低,其他各组的平均日采食量和料蛋比略有下降;T1和T3的死淘率有所降低;各组的蛋白高度、哈氏单位和蛋形指数差异不显著;T1和T2的蛋壳厚度和鸡蛋硒含量均显著提高,且均以T1最高。在粪便菌群结构方面,与CK相比,T1和T2的ACE指数和Chao1指数升高,但差异不显著;T1的Shannon指数降低,Simpson指数升高,但差异均不显著。T1粪便的菌群丰富度和多样性均呈上升趋势;在门分类水平,CK的优势菌群为厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes),占比分别为74.02%、9.14%和7.03%,试验组的优势菌群均为厚壁菌门和变形菌门,其中,T1的变形菌门占比显著高于CK,厚壁菌门占比与CK差异不显著;在属分类水平,CK和试验组的优势菌群均为乳杆菌属(Lactobacillus),其占比间均无显著差异;T1和T2的梭形杆菌属(Lysinibacillus)占比均显著高于CK,其他属组成的菌属与CK均无显著差异。【结论】在基础日粮中添加丁酸梭菌和富硒酵母能提高蛋鸡的部分生产性能,且有利于促进蛋鸡肠道优良菌群结构形成,以添加1.0 g/kg丁酸梭菌和0.2 mg/kg富硒酵母的饲喂效果最佳。

• 基于Sentinel-2A影像的复合轮作种植结构提取

  王钰, 董亚坤, 何紫玲, 王鹏, 赵昊, 曾维军,

  【目的】利用遥感技术探索云南大理洱海流域复合轮作种植结构提取方法,为流域作物种植结构的调整和管理提供理论参考。【方法】对洱海流域的Sentinel-2A影像进行多尺度分割,在光谱和纹理等常用特征的基础上加入位置特征构建分类特征集,选用C5.0决策树算法挖掘分类规则,使用混淆矩阵进行分类精度评价。【结果】作物分类中,光谱特征Mean_Green为分类最重要的参数,位置特征Y_Center主要区分紫叶莴笋和玉米,X_Center为提取蚕豆的重要特征之一。依据C5.0决策树分类规则绘制大春和小春时期的作物精细地块图,大春作物分为水稻、玉米、紫叶莴笋及其他作物,小春作物分为蚕豆、油菜、紫叶莴笋及其他作物,得到复合轮作种植结构共16种,其中,水稻—蚕豆和玉米—蚕豆轮作占流域内耕地总面积比例最大,分别为29.54%和23.66%;水稻—油菜和玉米—油菜轮作所占面积较小,分别占耕地总面积的2.05%和1.58%;大春和小春时期均种植紫叶莴笋的区域占耕地总面积的4.26%;其余11种轮作方式面积之和为7726.77 ha,占耕地总面积的38.91%。大春作物分类总体精度为80.00%,Kappa系数为0.7142,小春作物分类总体精度为81.75%,Kappa系数为0.6983。【建议】提取复合轮作种植结构时,建议考虑C5.0决策树算法并加入位置特征提取作物信息,针对复合轮作种植结构存在分布不均等问题,建议当地农业部门加强宣传引导,遵循因地制宜的原则,优化调整洱海流域农作物种植结构,提高流域农业种植生态、经济与社会效益。