南方农业学报杂志

南方农业学报杂志2023年第9期

• 北部湾中南部海域3种优势鱼类生态位研究

  黄亮亮, 杨伊恒, 王才广, 徐浩, 康斌,

  【目的】比较北部湾中南部海域3种优势鱼类元素组成及其多维化学计量生态位和碳氮稳定同位素营养生态位的差异,系统掌握该海域主要优势鱼类间的关系,同时为北部湾中南部海域渔业资源的可持续开发利用及科学管理提供参考依据。【方法】以2022年4月在北部湾中南部海域采集的3种优势种鱼类多齿蛇鲻(Saurida tumbil)32尾,大头白姑鱼(Pennahia macrocephalus)34尾,黄带绯鲤(Upeneus sulphureus)33尾为研究对象,测定其鱼体中20种元素(C、N、P、K、Ca、Na、Mg、Fe、Zn、Mn、Ti、Cr、Co、Ni、Cu、As、Ba、Cd、Pb和Sb)及碳、氮稳定同位素(δ13C和δ15N)含量,通过绘制多维化学计量生态位图和碳氮稳定同位素营养生态位图,比较分析3种优势鱼类元素组成及其生态位的种内和种间差异。【结果】北部湾中南部海域3种优势鱼类元素含量和碳氮稳定同位素含量存在明显的种间及种内差异,其超体积生态位排序为大头白姑鱼(280.97)>多齿蛇鲻(174.45)>黄带绯鲤(98.30),生态位面积排序为多齿蛇鲻(6.63)>黄带绯鲤(4.00)>大头白姑鱼(2.46)。3种优势鱼类种间和种内均存在一定程度的生态位重叠,如种间生态位重叠概率最高的是多齿蛇鲻与大头白姑鱼(14.04%),而种间生态位重叠概率最低的是多齿蛇鲻与黄带绯鲤(1.76%);种内生态位重叠最高的是黄带绯鲤,多齿蛇鲻次之,大头白姑鱼最小。此外,3种优势鱼类多维化学计量超体积生态位与种内差异有关,种内差异越大其超体积生态位越大。【结论】北部湾中南部海域3种优势鱼类元素含量和碳氮稳定同位素含量存在明显的种间及种内差异,多维化学计量生态位和碳氮稳定同位素营养生态位均可用于表征生物的生理特征及功能,但相对于稳定同位素营养生态位,多维化学计量生态位能更好地反映种内差异。因此,后续研究将深入探讨生物多维化学计量生态位的种间及种内差异,如渔业生物个体不同发育阶段的生态位变化,为渔业资源的可持续开发利用及科学管理提供参考依据。

• 前肛鳗线粒体基因组结构特征与系统发育关系研究

  王思格, 刘玉萍, 朱子妍, 汪雨柯, 杨天燕,

  【目的】分析前肛鳗线粒体基因组结构特征与系统发育关系,为前肛鳗的分类鉴定及种质资源现状评估提供理论依据。【方法】采用高通量测序技术获得前肛鳗线粒体基因组序列,分析其基因组成和结构特征,结合GenBank已公布的近缘种鱼类线粒体基因组序列,基于蛋白编码基因(PCGs)序列相似性使用最大似然法构建系统发育进化树,分析该鱼类在鳗鲡目中的亲缘关系及进化地位。【结果】前肛鳗线粒体基因组序列全长16690 bp,包含13个PCGs、22个tRNA、2个rRNA(12S rRNA和16S rRNA)及2个非编码区(D-loop和OL),碱基组成具有明显的A/T偏好性和反G偏倚,其中D-loop区AT含量最高(65.56%)。ATG是PCGs中最常见的起始密码子,6个基因以不完全密码子T-和TA-作为终止密码子。22个tRNA中仅tRNA-Ser(AGN)因缺失二氢尿嘧啶臂无法折叠成典型的三叶草形,且在t RNA-Leu(UUR)中识别到与哺乳动物线粒体转录终止因子(m TERF)结合位点高度相似的基序5'-TGGCAGAGCCTGG-3'。12S rRNA和16S rRNA的二级结构均由多茎环组成,且后者较前者更复杂。16S rRNA的结构域Ⅳ中存在与原核生物23S rRNA肽基转移酶中心(PTC)同源的保守多分支环(CML)。D-loop区中识别了扩展终止序列区(ETAS)、中央保守区(CSB-F、CSB-E和CSB-D)和保守序列区(CSB-1、CSB-2和CSB-3)。基于PCGs序列相似性构建的系统发育进化树显示,前肛鳗与寄生鳗、软泥鳗和考柯氏合鳃鳗的亲缘关系较近。【结论】前肛鳗线粒体基因组结构与大多数硬骨鱼类相似,长度介于鳗鲡目鱼类线粒体基因组长度范围之间,系统发育分析结果支持将前肛鳗归为合鳃鳗科前肛鳗属的分类地位。

• 基于三代全长转录组测序的极边扁咽齿鱼SSR分子标记开发

  吴晓雲, 陈叶雨, 龚全, 刘亚, 宋明江, 李飞扬, 李鹏程, 邹巧林, 欧军, 赖见生,

  【目的】基于三代全长转录组测序数据,开发极边扁咽齿鱼SSR分子标记,积累和丰富该物种遗传信息,为后期指导和优化人工繁殖技术提供理论参考。【方法】基于极边扁咽齿鱼三代全长转录组测序结果(PRJNA792686),分析SSR分布情况,筛选出具有多态性的SSR引物,并对2个流域37尾边扁咽齿鱼的遗传多样性进行分析。【结果】极边扁咽齿鱼单核苷酸重复SSR个数最多,占37.87%,二核苷酸~六核苷酸重复序列依次占31.77%、10.32%、1.29%、0.25%和0.10%;二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸和六核苷酸重复序列均以重复次数5~8次居多,分别占各自SSR总数的55.26%、94.90%、70.92%和89.52%;之后随重复次数增加而逐渐减少,当重复次数为21~24次时最低,分别占各自SSR总数的2.63%、0.04%、2.68%和0。单核苷酸重复序列以重复次数9~12次居多,占其SSR总数的71.43%;五核苷酸重复序列的重复次数主要集中在5~8次,占其SSR总数的83.33%;三核苷酸、四核苷酸和五核苷酸重复序列中,排名前5的序列分别是TA(17.07%)、AT(16.95%)、TG(15.29%)、AC(12.51%)和CA(9.71%);TTA(7.53%)、GAT(6.07%)、TAT(5.93%)、CAG(5.50%)和GAG(5.50%);TATC(4.83%)、TTTA(4.32%)、TTCT(3.81%)、TATT(3.56%)和TGTT(3.18%)。共设计38对SSR引物,最终筛选得到9对SSR多态性引物。2个流域的极边扁咽齿鱼等位基因数(Na)为3~29,其中,A流域极边扁咽齿鱼的期望杂合度(He)为0.484~0.931,香农指数(H′)为0.677~2.793;B流域极边扁咽齿鱼的He为0.315~0.948,H′为0.578~3.075。【结论】2个流域的极边扁咽齿鱼具有较高的遗传多样性。开发的9个多态性SSR分子标记可用于极边扁咽齿鱼育种和种质保护。

• 鳙goat基因序列特征及其时空表达模式分析

  王盼, 傅建军, 束世长, 朱文彬, 罗明坤, 王兰梅, 董在杰,

  【目的】探究鳙的ghrelin O-acyltransferase(goat)基因序列特征及时空表达模式,解析goat基因的潜在生物学功能。【方法】通过RACE扩增得到goat基因cDNA全长序列,采用实时荧光定量PCR对其在早期发育阶段、各组织和冬夏季4个组织(脑、肠道、肌肉和肝脏)中的表达特征进行检测;结合原位杂交和免疫组化技术分别从基因和蛋白水平解析goat基因在肠组织中的分布特征,并通过实时荧光定量PCR评估goat基因及通路相关基因的共表达模式。【结果】鉴定得到goat基因cDNA序列全长2255 bp,开放阅读框(ORF)长1116 bp,共编码371个氨基酸残基。推导氨基酸序列含7个跨膜结构域,并包含参与催化的天冬酰胺(第251位)和组氨酸(第282位)。同源比对分析发现鳙GOAT氨基酸序列与鲤科鱼类相似度极高。鳙goat基因在早期孵化时和出膜后5 d的表达水平均显著高于其他时期(P<0.05,下同);成体组织差异表达分析发现goat基因在肠道中表达量最高;goat基因在夏季脑、肠道和肌肉组织的相对表达量均显著高于冬季。原位杂交试验结果显示goat基因在肠道中表达信号较强,且肠道切片的免疫组化试验显示肠黏膜中存在GOAT与GHRL共定位的阳性信号。goat基因与生长激素的合成、分泌和作用通路(ko04935)中相关基因存在共表达关系。【结论】goat基因具有MBOAT家族的典型结构特征,可能通过与摄食相关基因(ghrl等)协作来参与鳙摄食调控和生长代谢适应等生物学过程。

• 大刺鳅基因组中微卫星分布特征分析

  谢佳燕, 唐晟, 孙赫英,

  【目的】通过查找和分析大刺鳅基因组中微卫星序列的分布规律及特征,为开展大刺鳅种质资源评估和分子标记辅助育种提供理论基础。【方法】基于大刺鳅基因组序列数据,采用MISA挖掘微卫星信息,利用生物信息学方法分析大刺鳅基因组中微卫星序列的分布规律及组成特征。【结果】从大刺鳅基因组中共筛选获得19020个微卫星,其中16025个为完全型微卫星;分布于2号染色体上的微卫星数目最多,24号染色体上的微卫星数目最少,分别占微卫星总数的10.26%和1.94%;单核苷酸为数目最多的微卫星,六核苷酸的最少。在完全型微卫星中,数目最多的前4种基元类型依次是A/T、AC/GT、G/C和AG/CT,分别占微卫星总数的37.82%、29.57%、6.88%和6.77%。微卫星基元重复次数的分布范围在5~104次,主要发生在重复5~6次和10~11次。微卫星长度区间为10~192 bp,主要分布在10~36 bp,占其总数的92.46%;微卫星数目最多的长度为12 bp,占其总数的15.22%。Pearson相关分析结果表明,大刺鳅微卫星长度与其数目呈极显著负相关(P<0.01)。GO功能注释分析结果发现,微卫星的基因主要富集到生物学过程、分子功能和细胞组分3个类群,富集最显著的条目为细胞核。【结论】利用基因组数据筛选大刺鳅基因组中微卫星可用性高且具有较高的多态性潜能,可为高效开发微卫星分子标记提供遗传学数据。

• 斑马鱼gdnfa基因表达特征及gdnfa+/-F1基因型鉴定

  杨倩, 王顺哲, 刘璎慧, 刘祎, 汪泳昌, 李胜忠, 张俊杰,

  【目的】明确gdnfa基因在斑马鱼中的表达特征及其进化保守性,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立gdnfa+/-F1代杂合突变体,为后续生成gdnfa-/-F2代纯合突变体打下基础,同时为探讨gdnfa基因在斑马鱼性腺分化和发育中的作用机制提供理论依据。【方法】通过下载不同物种的GDNF蛋白氨基酸序列,并分析其保守结构域,探究该基因在不同物种中的进化保守性。利用实时荧光定量PCR检测gdnfa基因在6月龄斑马鱼不同组织中的表达情况,并通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得gdnfa F0代突变个体,随后与野生型回交获取gdnfa+/-F1代突变个体,并分析其基因型及突变类型。最后,通过组织石蜡切片分析3月龄gdnfa+/-F1代个体与同期野生型性腺组织间的差异。【结果】斑马鱼GDNFA蛋白分子量为26.89 kD,由235个氨基酸残基组成,包含13个疏水氨基酸和51个酸性氨基酸,理论等电点(pI)为8.455,且该蛋白存在1个TGF-β结构域。斑马鱼GDNFA蛋白序列进化较保守,与非洲爪蟾、小鼠和人类GDNFA蛋白具有相同的TGF-β结构域,推测GDNFA蛋白序列在鱼类、人类和爬型动物类中进化保守。gdnfa基因在6月龄斑马鱼的性腺(精巢和卵巢)、肾脏、肝脏、鳃和肌肉组织中均有表达,但精巢中gdnfa基因的相对表达量显著高于其他组织(P<0.01)。繁育得到的48尾斑马鱼gdnfa+/-F1代杂合突变体中产生了3种突变类型,分别为在靶点附近插入2个碱基(△+2 bp)、缺失2个碱基(△-2 bp)和缺失12个碱基(△-12 bp)。48尾gdnfa+/-F1代个体的雄性∶雌性=14∶34,呈现出明显的雌性性别偏向。与野生型斑马鱼GDNFA蛋白相比,斑马鱼gdnfa+/-F1代个体的GDNFA蛋白三级结构发生了明显变化。性腺石蜡切片观察发现,部分gdnfa+/-F1代个体(△-2 bp)精巢中A型精原细胞团减少,B型精原细胞团排列更疏松;部分个体(△-12 bp)卵巢中更多的皮质泡卵母细胞累积。【结论】斑马鱼gdnfa基因与其他硬骨鱼类平行进化,且gdnfa基因在硬骨鱼类的进化过程中具有高度保守性;由于gdnfa基因在斑马鱼精巢发育中发挥作用,故gdnfa+/-F1代个体性别比例偏向于雌性,推测其参与斑马鱼性别分化。gdnfa+/-F1代杂合体部分功能的缺失对精原细胞的产生、皮层滤泡期卵母细胞到初级生长期卵母细胞的过渡阶段起到阻滞作用。获得的gdnfa+/-F1代个体可用于生成gdnfa-/-F2代纯合个体。

• 团头鲂Rheb基因分子特征及其对氨氮胁迫的响应

  王恒杰, 李梦娇, 张婷, 赵蔚蓝, 王灿莉, 宋呈文, 罗思, 袁向阳,

  【目的】探究团头鲂Rheb基因分子特征及其对氨氮胁迫的响应,为明确氨氮胁迫通过Rheb蛋白介导的通路调控鱼类生长机制及后期药物定点治疗提供理论依据。【方法】以团头鲂幼鱼为研究对象,采用c DNA末端快速扩增(RACE)克隆团头鲂脑组织中Rheb基因cDNA序列,对其进行生物信息学分析及构建系统发育进化树,并采用实时荧光定量PCR检测Rheb基因在团头鲂不同组织中的表达模式。设氨氮胁迫组和对照组,通过曲线拟合计算氨氮胁迫下团头鲂的96 h半致死浓度(96 h-LC50),对末重和特定生长率(SGR)进行组间显著性检验。【结果】Rheb基因c DNA序列全长1488 bp,其中5'和3'端非编码区(UTR)分别为245和688 bp,开放阅读框(ORF)为555 bp,共编码184个氨基酸残基。Rheb蛋白的平均亲水性指数为-0.196,表明Rheb为亲水性蛋白;其二级结构中,α-螺旋占38.59%,延伸链占20.11%,β-转角占6.52%,无规则卷曲占34.78%。基于Rheb蛋白氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树显示,团头鲂与同科的斑马鱼聚为一支,而与软体动物(虾夷扇贝和美洲牡蛎)及节肢动物(拟穴青蟹和三疣梭子蟹)的亲缘关系较远。团头鲂96 h-LC50的氨氮浓度为54.45 mg/L;与对照组相比,氨氮胁迫下团头鲂的末重和SGR显著降低(P<0.05,下同);胁迫组Rheb基因的相对表达量显著低于对照组。【结论】Rheb蛋白存在于团头鲂各组织中,其中脑组织中含量最高,长期氨氮胁迫能降低团头鲂的生长指标和Rheb基因表达水平,推测Rheb蛋白是通过某种信号通路参与氨氮胁迫下团头鲂体重的调控。

• 凡纳滨对虾CCT6基因克隆及SNP位点筛选

  贺莹, 李云, 刘红,

  【目的】克隆凡纳滨对虾CCT6基因并筛选与生长相关的SNP位点,为选育生长快速的凡纳滨对虾分子标记辅助育种提供参考依据。【方法】通过克隆获得凡纳滨对虾CCT6基因的cDNA和DNA序列,应用ExPASy、InterPro、TMHMM、SOPMA及SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析,运用实时荧光定量PCR检测CCT6基因在凡纳滨对虾不同组织及2个不同生长速度的凡纳滨对虾群体中的表达情况,利用直接测序法筛选凡纳滨对虾CCT6基因SNP位点并将其与凡纳滨对虾生长性状进行关联分析。【结果】凡纳滨对虾CCT6基因cDNA序列全长为1835 bp,5'和3'非编码区(UTR)分别为55和193 bp,开放阅读框(ORF)为1587 bp,共编码531个氨基酸残基,DNA全长为15873 bp,具有11个外显子和10个内含子。CCT6基因在凡纳滨对虾眼柄、鳃、胃、肝胰腺、心脏、肠道和肌肉组织中均有表达,在肠道组织中相对表达量显著高于其他组织(P<0.05,下同)。A群体凡纳滨对虾最终体质量、最终体长等生长指标显著高于B群体,生长快速的凡纳滨对虾A群体肠道组织中CCT6基因的相对表达量显著高于B群体。于凡纳滨对虾CCT6基因的DNA序列上筛选到6个SNP位点,其中2个SNP位点位于DNA序列的外显子区域,4个位于DNA序列的内含子区域。其中位于内含子区域的C14895C>T位点与凡纳滨对虾的生长性状显著相关,C14895C>T位点CC基因型凡纳滨对虾个体的体长和体质量显著高于TT基因型,且CC基因型在A群体凡纳滨对虾中的数量高于B群体。【结论】CCT6基因在凡纳滨对虾生长发育中具有重要作用,生长快速的A群体趋于纯合的CC基因型,C14895C>T位点可作为选育生长快速的凡纳滨对虾分子标记辅助育种的候选标记。

• 花鲈OPN5基因克隆及其在光周期处理下的表达特征

  任红乐, 邱丽华, 闫路路, 赵超, 张博, 丘高峰, 王鹏飞,

  【目的】通过克隆花鲈视蛋白5(OPN5)基因(LmOPN5)序列,检测视网膜、血管囊、下丘脑和垂体中LmOPN5基因在不同光周期下的表达水平,探究光周期对LmOPN5基因表达的影响,为深入研究花鲈感知光周期信号提供参考依据。【方法】通过PCR和RACE克隆获得LmOPN5基因全长序列,并进行生物信息学分析;应用实时荧光定量PCR检测LmOPN5基因在各组织中的相对表达量;再比较不同光周期(常光周期组12 L∶12 D,短光周期组8 L∶16D,长光周期组16L∶8D;L:光照时间,D:黑暗时间)条件下,视网膜、血管囊、下丘脑和垂体中LmOPN5基因表达的变化。【结果】LmOPN5基因cDNA全长1732 bp,其中开放阅读框(ORF)长1056 bp,共编码351个氨基酸残基。Lm OPN5蛋白分子量为39.26 kD,理论等电点(pI)为9.17。LmOPN5蛋白二级结构中α-螺旋占40.17%、无规则卷曲占34.76%、延伸链占22.51%、β-转角占2.56%,以α-螺旋和无规则卷曲为主。氨基酸序列同源比对分析结果显示,LmOPN5氨基酸序列与其他硬骨鱼类的OPN5氨基酸序列相似性为82.7%~92.0%,与哺乳动物OPN5氨基酸序列相似性较低。LmOPN5基因在花鲈脑组织分布广泛,尤其在下丘脑、视叶、垂体、端脑和血管囊中的相对表达量较高;同时在视网膜的相对表达量也较高。在视网膜中,LmOPN5基因相对表达量在不同光周期处理下发生显著变化(P<0.05,下同),其中长光照周期促进LmOPN5基因表达,短光照周期抑制LmOPN5基因表达;在血管囊中,长光周期条件下LmOPN5基因相对表达量显著高于常光周期;在下丘脑中,LmOPN5基因相对表达量在3种光周期处理下无显著变化(P>0.05);在垂体中,短光周期条件下LmOPN5基因相对表达量显著高于长光周期和常光周期。【结论】LmOPN5基因序列在硬骨鱼中较保守;不同光周期处理影响视网膜、血管囊和垂体中LmOPN5基因表达,表明花鲈不同组织对光周期的反应不一致,花鲈对光周期的感应具有组织特异性。

• 疣吻沙蚕转录组SSR位点鉴定及特征分析

  杨尉, 司圆圆, 许瑞雯, 陈兴汉,

  【目的】鉴定疣吻沙蚕转录组中简单重复序列(SSR)位点,并分析其分布规律,为该物种多态性SSR分子标记的高效开发提供理论依据。【方法】利用高通量测序技术获得疣吻沙蚕的转录组数据,经过滤、组装后使用MISA搜索鉴定SSR位点,分析其序列特征及分布规律,初步验证SSR引物的有效性,并对有效扩增引物进行多态性分析。【结果】从转录组数据组装获得79420条Unigenes,总长度为104411064 bp,N50值和N90值分别为1902和331 bp。从79420条Unigenes中鉴定到9932个SSR位点,分布在8707条Unigenes上,其中1029条至少包含1个SSR位点,SSR出现频率为8.49%,发生频率为7.43%,丰度为58.85个/Mb(未计入单核苷酸重复)。SSR重复类型共133种,重复次数为4~26次,主要集中在4~15次,长度≥20 bp的SSR约占SSR总数的20%。SSR优势重复基序为二核苷酸、单核苷酸和三核苷酸,发生频率分别为40.29%、32.12%和21.76%,其中二核苷酸重复基序以AT/TA为主,占比79.88%,单核苷酸和三核苷酸分别以A/T和AGC/GCT为主,占比分别为65.92%和29.06%。SSR位点以中等多态性的Ⅱ型为主,共有7296条,占SSR总数的80%,而高度多态性的Ⅰ型有1813条,占SSR总数的20%。筛选到11对多态性引物,每对引物平均产生3.73个多态性片段。【结论】疣吻沙蚕转录组SSR类型丰富,且具有较高的多态性,可用于SSR分子标记开发,对其种质资源评价与保护利用、种群遗传学及分子育种研究等具有实用价值。

• 方格星虫线粒体全基因组密码子偏好性分析

  韩春丽, 杨果豪, 李天香, 王健宇, 熊忠萍, 许尤厚, 朱鹏, 杨家林, 王鹏良,

  【目的】探讨方格星虫线粒体基因组密码子偏好性,明确自然选择和基因突变对其密码子偏好性的作用,并充分利用密码子偏好性的特点,为方格星虫分子遗传改良提供科学依据。【方法】根据方格星虫线粒体基因组序列,选取长度大于300 bp且以ATG开头的10个非重复基因序列为研究对象,运用CondonW 1.4.2分析方格星虫线粒体基因组密码子偏好性参数,通过中性绘图分析、ENC-plot分析、PR2-plot分析及对应分析明确方格星虫线粒体基因组密码子偏好性形成的主导因素,并依据高频密码子和高表达密码子筛选出方格星虫线粒体基因组最优密码子。【结果】方格星虫线粒体基因组密码子的GC含量因位置而异,GC1、GC2和GC3的平均值分别为51.06%、40.19%和47.11%,GC含量平均值为46.12%;ENC、CAI和CBI的平均值依次为50.022、0.150和-0.023;RSCU>1.00的同义密码子有31个,以A或C结尾的密码子占87.10%。中性绘图分析结果表明,GC12与GC3无相关性,相关系数为0.05;ENC-plot分析结果表明,全部参试基因均位于标准曲线下方,说明方格星虫线粒体基因组密码子偏好性以自然选择为主导;PR2-plot分析结果表明,除ND6基因位于左侧x轴上外,其余9个参试基因全部分布在坐标系的第二象限;对应分析结果表明,前4轴的贡献率分别为23.86%、14.96%、12.21%和10.82%,在构建的平面坐标系内细胞色素C类基因分布相对集中,而NADH还原酶类基因分布较分散。依据方格星虫线粒体基因组的高频密码子和高表达密码子,最终确定GUA、CUC、CAC、CUU、AUU、CCU、GCA、AAC及GAA为方格星虫线粒体基因组最优密码子。【结论】方格星虫线粒体基因组密码子偏好性较弱,偏好于A/C结尾的密码子;自然选择在方格星虫线粒体基因组密码子偏好性形成中占主导地位。因此,可根据宿主线粒体基因组密码子偏好性优化外源基因,以提高其表达效率,加速方格星虫品种的遗传改良。

• 尼罗罗非鱼S100A16基因克隆及其功能分析

  陈钊峰, 苏海明, 黄瑜, 鲁义善, 王蓓, 简纪常, 蔡佳,

  【目的】研究尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)钙结合蛋白S100A16的结构特征、系统进化关系及组织表达分布情况等,进一步分析S100A16在抗菌免疫中的作用,为深入研究S100A16基因在鱼类免疫防御中的功能提供参考依据。【方法】根据S100A16基因序列设计特异性引物克隆尼罗罗非鱼S100A16基因(On-S100A16),构建原核表达载体并采用SMART 4.0、DNAMAN 9.0及MEGA 6.0等在线软件对On-S100A16氨基酸序列进行生物信息学分析。通过实时荧光定量PCR检测On-S100A16在尼罗罗非鱼各组织中的分布情况及无乳链球菌感染后在尼罗罗非鱼各组织中的表达变化,并制备融合蛋白用于孵育尼罗罗非鱼头肾淋巴细胞后,检测炎症相关因子基因的表达情况。【结果】克隆获得的On-S100A16基因编码区长度为276 bp,共编码91个氨基酸残基,含有S100保守结构域。On-S100A16氨基酸序列与斑马拟丽鱼、杂色鳉、大口黑鲈等其他鱼类的S100A16氨基酸序列具有较高的相似度,系统发育进化分析也显示On-S100A16与斑马拟丽鱼S100A16的亲缘关系最近。On-S100A16基因在尼罗罗非鱼的各组织中广泛表达,在肝脏组织中的相对表达量最高;经无乳链球菌感染后,On-S100A16基因在尼罗罗非鱼脑、肠道和脾脏组织中的表达量呈上调趋势,且均在感染24 h后达峰值。成功制备融合蛋白S100A16后用于孵育头肾淋巴细胞,实时荧光定量PCR检测结果表明,抗炎因子基因IL-4和TLR1的相对表达量极显著上调(P<0.01,下同),促炎因子基因IL-6和TNF-α的相对表达量则极显著下调。【结论】On-S100A16氨基酸序列含有S100蛋白家族典型的S100结构域,其可能具有与其他S100蛋白相似的生物学功能。On-S100A16通过调控淋巴细胞活性来参与尼罗罗非鱼的抗菌免疫反应。

• 鳜肌钙蛋白基因鉴定及其序列结构与表达特征分析

  梁旭, 张琦, 李帅帅, 姚晓丽, 赵金良,

  【目的】探究鳜(Siniperca chuatsi)骨骼肌生长发育中肌钙蛋白基因的表达特征,为鳜生长发育的研究提供基础资料。【方法】基于鳜转录组数据与基因组数据联合分析,筛选鉴定出鳜肌钙蛋白基因,通过BioEdit、ClustalW、MEGA5.0、SWISS-MODEL及SMART等在线软件对鳜肌钙蛋白进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测鳜不同肌肉组织中肌钙蛋白基因的表达特异及孵化后10~60 d(10~60 dph)骨骼肌中肌钙蛋白基因的表达规律。【结果】共鉴定出11个鳜肌钙蛋白基因3个TnnC基因(TnnC1a、TnnC1b和TnnC2)、5个TnnI基因(TnnI1a、TnnI1b、TnnI1c、TnnI1al和TnnI2)及3个TnnT基因(TnnT1、TnnT2a和TnnT3a),各基因亚型间在基因结构、结合位点及蛋白三级结构存在明显差异,11个鳜肌钙蛋白基因分布在4条染色体上。鳜肌钙蛋白基因具有组织特异性:TnnC1a基因在慢肌中高表达,在心肌中的相对表达量次之;TnnC1b基因在慢肌中也呈高表达,除心肌外,TnnC1a和TnnC1b基因在其他类型肌肉组织中具有相似的表达模式;TnnC2基因在快肌和颊肌中高表达;TnnI1a、TnnI1c和TnnI1al基因在慢肌中高表达,且具有相似的表达模式;TnnI1b基因在心肌中高表达,慢肌中的相对表达量次之;TnnI2基因在快肌和颊肌中高表达;TnnT1基因在慢肌中高表达,TnnT2a基因在心肌中高表达,TnnT3a基因在快肌和颊肌中高表达。随着发育时间的推移,TnnC1a、TnnC1b、TnnI1b、TnnI1c、TnnI1al和TnnT1等基因的表达显著下调(P<0.05),但TnnC2、TnnI2和TnnT3a基因在30~60 dph仍维持在相对较高的表达水平。【结论】基于鳜转录组数据与基因组数据联合分析,共鉴定出11个鳜肌钙蛋白基因,其中TnnC2、TnnI2和TnnT3a基因可作为鳜骨骼肌快肌生长发育的重要分子标记基因。

• 花鲈Phoenixin-20基因克隆及饥饿复投喂对其表达的影响

  李太初, 邱丽华, 张瑞琼, 闫路路, 赵超, 张博, 张博, 乔秀亭, 王鹏飞,

  【目的】明确花鲈Phoenixin-20基因(LmPNX-20)是否参与花鲈的摄食调控过程,进而揭示PNX-20在鱼类摄食调节机制中的作用,同时为丰富和完善花鲈内分泌调控网络提供理论依据。【方法】通过PCR和RACE克隆LmPNX-20基因序列,采用ExPASy、SignalP 5.0、ProtScale、NetPhos 3.1及ClustalX等在线软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测分析LmPNX-20基因在花鲈各组织中的表达特征及不同饥饿复投喂策略正常投喂(F)、饥饿3 d(H3)、饥饿3 d复投喂1 d(R3-1)、饥饿3 d复投喂2 d(R3-2)、饥饿3 d复投喂3 d(R3-3),以及饥饿7 d(H7)、饥饿7 d复投喂1d(R7-1)、饥饿7d复投喂2d(R7-2)、饥饿7d复投喂3d(R7-3)对LmPNX-20基因表达的影响。【结果】LmPNX-20基因开放阅读框(ORF)长度为210 bp,共编码69个氨基酸残基;其编码蛋白分子量为7.87 kD,理论等电点(pI)为9.85。LmPNX-20氨基酸序列含有5个磷酸化位点,但不存在信号肽;LmPNX-20氨基酸序列与硬骨鱼类的PNX-20氨基酸序列相似性较高,为69.70%~89.86%。LmPNX-20基因在花鲈脑组织中呈广泛表达分布,尤其在垂体和下丘脑中的相对表达量较高。经饥饿复投喂处理后花鲈幼鱼全脑组织中的LmPNX-20基因表达发生明显变化,在经历3和7 d饥饿复投喂1 d的花鲈幼鱼全脑组织中LmPNX-20基因的相对表达量显著上调(P<0.05);且与饥饿3 d复投喂的花鲈幼鱼相比,饥饿7 d复投喂的花鲈幼鱼全脑组织LmPNX-20基因表达均呈上调趋势。【结论】LmPNX-20基因在鱼类的进化过程中较保守,且在生长轴(下丘脑、垂体和肝脏)和生殖轴(下丘脑、垂体和性腺)有较高表达水平,可能参与花鲈的生长及生殖等生理过程。不同饥饿复投喂处理影响花鲈幼鱼全脑组织LmPNX-20基因的表达,复投喂后该基因表达量明显升高,说明LmPNX-20基因对花鲈幼鱼摄食调控具有一定促进作用。

• 苏丹鱼形态性状对体质量的相关性及通径分析

  曲照球, 唐瞻杨, 麻艳群, 黄婷, 肖俊, 陈丽婷, 郭忠宝, 罗永巨, 孙羽懿,

  【目的】明确人工养殖条件下苏丹鱼(Leptobarbus hoevenii)体质量与形态性状的相关性,为苏丹鱼优良形态性状的选育提供理论依据。【方法】从人工养殖的4月龄苏丹鱼池塘中随机挑选苏丹鱼116尾,测量其体质量(Y)及全长(X1)、体长(X2)、头长(X3)、躯干长(X4)、体高(X5)和体宽(X6)等形态性状,利用相关分析和通径分析法筛选影响体质量的主要性状,并以逐步回归分析法构建多元回归方程。【结果】苏丹鱼的全长、体长、头长、躯干长、体高和体宽等形态性状与体质量间均呈极显著正相关(P<0.01)。通径分析结果表明,全长、体长、体高和体宽是影响苏丹鱼体质量的主要形态性状,对体质量的直接作用排序为体长(0.364)>全长(0.291)>体高(0.245)>体宽(0.143),间接作用排序为体高(0.645)>全长(0.644)>体宽(0.589)>体长(0.587)。决定系数(R2)分析结果表明,全长、体长、体高和体宽对体质量的直接R2与间接R2总和为0.941(大于0.850),说明苏丹鱼的体质量主要由这4个形态性状决定。多元回归分析结果表明,苏丹鱼体质量与形态性状的多元回归方程为Y=-94.861+4.385X2+8.089X5+6.002X6+2.842X1(R2=0.946)。将全长、体长、体高和体宽4个形态性状分别与体质量进行模型拟合,最优拟合模型分别为三次函数、幂函数、幂函数和三次函数,方程式分别为Y=0.265X13-0.003X12+8.819、Y=4.278X20.290、Y=0.766X50.383和Y=0.032X63+1.044,对应的R2分别为0.892、0.925、0.817和0.552。【结论】在苏丹鱼生产及选育过程中,体长可作为主要目标性状进行选择,全长、体高和体宽可作为辅助性状进行选择。

• 斑节对虾新型抗菌肽ALF-like基因克隆表达及其抗菌功能分析

  梁子莹, 邱丽华, 王鹏飞, 张博, 闫路路, 乔秀亭, 赵超,

  【目的】克隆并明确斑节对虾(Penaeus monodon)新型抗菌肽ALF-like基因(PmALF-like)的结构特征、组织表达分布规律及副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)刺激后的表达变化,探究其在抗菌先天免疫中的作用与功能,为阐明斑节对虾抗菌免疫调控机制提供参考依据。【方法】依据PmALF-like基因表达序列标签(EST)序列,利用RACE扩增获得PmALF-like基因cDNA全长序列,通过ProtParam、SignalP 5.0、MegAlign和MEGA 7.0等在线软件进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR检测PmALF-like基因在斑节对虾不同组织中的表达特征及其在副溶血弧菌刺激后的表达模式;利用原核重组方法获得PmALF-like成熟肽的重组蛋白(去信号肽),并通过液体培养基法和牛津杯法等探究Pm ALF-like成熟肽抑制细菌生长的作用。【结果】PmALF-like基因cDNA序列全长1242 bp,包括45 bp的5'端非编码区(5'-UTR)、798 bp的3'端非编码区(3'-UTR)和399 bp的开放阅读框(ORF),共编码132个氨基酸残基;分子量为15.26k D,理论等电点(pI)为7.67;利用SignalP5.0对PmALF-like蛋白进行信号肽预测,结果表明其第18个氨基酸处存在信号肽剪切位点。实时荧光定量PCR检测结果表明,PmALF-like基因在斑节对虾血淋巴、肝胰腺、鳃、肠道、肌肉等组织中均有不同程度的表达,以肝胰腺中的相对表达量最高,血淋巴次之,肌肉组织中的相对表达量较少。副溶血弧菌刺激后,斑节对虾肝胰腺组织PmALF-like基因产生免疫应答,其基因相对表达量在6~72 h显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)上调。利用原核表达方法在体外成功获得不含信号肽的PmALF-like成熟肽,借助液体培养基法和牛津杯法发现PmALF-like成熟肽对维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、副溶血弧菌及嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的生长均有明显抑制作用。【结论】PmALF-like基因在斑节对虾各组织中广泛表达,其成熟肽对维氏气单胞菌、副溶血弧菌及嗜水气单胞菌的生长具有明显抑制作用。

• 凡纳滨对虾RASSF基因克隆及其响应不同病原刺激的表达分析

  肖伟, 戚建英, 姚元茂, 史黎黎,

  【目的】明确凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)RASSF基因(LvRASSF)的分子结构、组织表达模式及其应答不同病原感染的表达特征,为深入研究LvRASSF基因在凡纳滨对虾先天性免疫中的功能及作用机制打下基础。【方法】利用PCR克隆得到LvRASSF基因开放阅读框(ORF)序列,并对其进行生物信息学分析及构建系统发育进化树,运用实时荧光定量PCR分析LvRASSF基因在12个组织中的表达情况及不同病原感染后的表达变化。【结果】LvRASSF基因ORF序列长669 bp,共编码222个氨基酸残基,蛋白分子量为89.2 kD,理论等电点(pI)为5.06。LvRASSF氨基酸序列包含1个RA结构域和1个SARAH结构域。基于RASSF氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树显示,凡纳滨对虾与斑节对虾(Penaeus monodon)和中国对虾(Penaeus chinensis)的亲缘关系较近。LvRASSF基因在各组织中均有表达,其中在血细胞中的相对表达量最高,在眼柄中的最低。感染白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)和十足目虹彩病毒(Decapod iridescent virus 1,DIV1)后,LvRASSF基因在凡纳滨对虾鳃组织中的相对表达量极显著上调(P<0.01,下同),而在血细胞中短期极显著上调后又极显著下调;感染副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)后LvRASSF基因在凡纳滨对虾鳃和血细胞中的相对表达量整体呈上调趋势。【结论】LvRASSF蛋白存在RASSF家族典型的RA结构域和SARAH结构域,在进化上较保守。LvRASSF基因广泛表达于凡纳滨对虾各组织中,以血细胞中的相对表达量最高。不同病原感染后LvRASSF基因在血细胞和鳃组织中相对表达量发生极显著变化,表明LvRASSF基因在凡纳滨对虾的抗病免疫中发挥重要作用。

• 中华鳖甘露糖受体MRC2基因克隆及嗜水气单胞菌感染后的组织表达特征

  张慧, 田钰, 靳利忠, 张星玥, 韩乐, 王晓清, 胡亚洲,

  【目的】探究中华鳖(Pelodiscus sinensis)甘露糖受体C2(Mannose receptor C type 2)基因PsMRC2在应答嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染中的免疫功能,为中华鳖抗细菌感染的免疫机制研究提供理论依据。【方法】通过PCR克隆PsMRC2基因开放阅读框(ORF)序列,对其进行生物信息学和系统发育进化分析,并以实时荧光定量PCR检测PsMRC2基因在中华鳖各组织中表达谱及嗜水气单胞菌感染后的时序表达。【结果】PsMRC2基因ORF序列为4086 bp,共编码1361个氨基酸残基。PsMRC2蛋白结构域包括1个纤连蛋白Ⅱ型(FNⅡ)结构域(第61~109位氨基酸)、8个串联的C型凝集素(CLECT)结构域(第116~1276位氨基酸)、1个跨膜结构域(第1295~1317位氨基酸)。通过SOMPA预测得到PsMRC2蛋白二级结构包含706个无规则卷曲(占51.87%)、302个延伸链(占22.19%)、289个α-螺旋(占21.23%)和64个β-转角(占4.70%);SWISS-MODEL预测PsMRC2蛋白三级结构匹配的模板与PsMRC2氨基酸序列相似性为90%,预测结果可信。基于PsMRC2蛋白氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树显示,中华鳖与龟类的亲缘关系最近,而与鱼类相距较远。PsMRC2基因在中华鳖的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠道、肌肉、脑和肺脏组织中均有表达,以脾脏组织中的相对表达量最高。感染嗜水气单胞菌后,PsMRC2基因在中华鳖肝脏、脾脏、肾脏和肠道组织中的相对表达量均呈上调趋势。【结论】PsMRC2基因在进化上较保守,广泛表达于中华鳖各组织中,参与中华鳖抗细菌感染的免疫应答过程。

• 鳗鲡疱疹病毒ORF115基因克隆、转录时相分析及原核表达

  陈曦, 杨金先, 陈华, 陈强, 葛均青,

  【目的】克隆鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)ORF115基因,获得ORF115基因序列生物信息学特征,分析其在病毒入侵细胞过程中的转录时相并进行原核表达,为解析ORF115基因的特性和功能及开发免疫学诊断技术和亚单位疫苗打下基础。【方法】根据GenBank已公布AngHV参考株(NC_013668)的基因序列,设计特异性引物扩增ORF115基因,从分离的AngHV-FJ福建株(AngHV-FJ)基因组中扩增出ORF115基因,克隆至pMD19-T载体,经酶切鉴定和测序验证,获得ORF115基因序列。采用Softberry、ProtParam、TMHMM、SignalP 5.0、PSORTⅡ及BepiPred等在线软件进行生物信息学分析;采用反转录PCR(RT-PCR)对ORF115基因进行转录时相分析;将ORF115基因克隆至表达载体p ET-32a,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测及Western blotting鉴定。【结果】克隆获得的AngHV-FJ ORF115基因全长318 bp,与GenBank已发布的参考序列相似性为100%;生物信息学预测表明,AngHV-FJ ORF115基因编码蛋白的分子量为11.8 kD,理论等电点(p I)为6.04,不稳定系数为16.38,总平均亲水性指数为0.172,属酸性弱疏水蛋白,较稳定;OR115蛋白存在跨膜结构,无信号肽,主要分布于细胞质中,有长片段抗原表位;转录时相分析结果表明,ORF115基因的转录本在病毒感染细胞后6 h即可检出,于感染24 h达峰值,随后无明显变化,属于病毒晚期基因。SDS-PAGE及Western blotting分析结果显示,ORF115基因可在大肠杆菌中表达,表达蛋白大小与预期一致,约32 kD。【结论】AngHV ORF115基因属于病毒晚期基因,其编码蛋白属酸性弱疏水蛋白,有长片段抗原表位,可能在病毒感染晚期发挥作用。获得的ORF115原核表达蛋白可用于制备多克隆抗体及AngHV亚单位疫苗开发。

• 湘云鲫2号肠道干细胞标志物LGR6分子特征及其多克隆抗体制备

  胡聂文, 唐仪阳, 冯孟哲, 周泽军,

  【目的】克隆湘云鲫2号肠道干细胞标志物LGR6(3nLGR6)并制备多克隆抗体,为从肠道干细胞角度揭示湘云鲫2号的抗病机制提供技术支持。【方法】通过PCR扩增3nLGR6基因开放阅读框(ORF)序列,采用InterProScan、TMHMM Server 2.0、ExPASy Proteomics Server、SignalP 5.0、PSORTⅡPrediction、SoftBerry-Psite、SWISS-MODEL及MEGA 11.0等在线软件进行生物信息学分析;利用原核表达系统表达融合蛋白,以纯化的融合蛋白免疫BALB/c雌性小鼠制备多克隆抗体,基于免疫组织化学分析3nLGR6在湘云鲫2号肠组织中的分布情况。【结果】3nLGR6基因ORF序列全长2874 bp,共编码957个氨基酸残基;3nLGR6蛋白理论分子量约105.4 kD,理论等电点(p I)为5.44,在其N端有1个亮氨酸重复序列结构域,C端存在1个7次跨膜结构的GPCR结构域,且在18Gly与19Ser间存在信号肽切割位点(Sec信号肽)。3nLGR6与其他硬骨鱼类的LGR6氨基酸序列高度同源,其中与二倍体斑马鱼的相似性为92.28%。与鱼类LGR6作用密切的基因有LGR4、RNF43、RSPO2、CTNNB1、APC和CTNNA1,主要涉及Wnt信号通路和Adherens junction信号通路。以纯化得到的融合蛋白3nLGR6免疫BALB/c雌性小鼠,能成功制备出小鼠抗3nLGR6多克隆抗体,且免疫组化试验结果显示该抗体可特异性识别湘云鲫2号肠道组织中的3nLGR6。【结论】3nLGR6与其他物种的LGR6氨基酸序列高度同源,其结构和功能相对较保守。制备获得的小鼠抗3nLGR6多克隆抗体能特异性识别湘云鲫2号肠道内源性3nLGR6,为后续深入研究LGR6在硬骨鱼组织中的表达情况及揭示LGR6在肠道黏膜稳态中的作用机制提供了技术支撑。

• 抗石斑鱼虹彩病毒药物的体外筛选

  潘赞彬, 郑家颖, 郭茜茜, 潘国俊, 秦启伟, 黄晓红, 黄友华,

  【目的】体外筛选抗石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)的药物,为石斑鱼虹彩病毒病防控提供理论依据。【方法】应用石斑鱼脾脏组织细胞系(Grouper spleen,GS)-SGIV感染模型,从4种药物盐酸金刚烷胺(AMA)、更昔洛韦(GCV)、绿原酸(CGA)和黄芩苷(BI)中筛选有效的体外抗SGIV药物。通过显微镜观察和细胞活力检测不同药物对GS细胞的毒性,确定不同药物对GS细胞的安全工作浓度后,通过实时荧光定量PCR、蛋白印迹分析等探究药物对SGIV感染复制的调节作用。【结果】细胞活力检测结果显示,4种药物AMA、GCV、CGA和BI处理GS细胞的最高安全工作浓度分别为200、200、1600和40μg/mL。显微镜下观察发现,AMA和GCV处理GS细胞后对SGIV感染的细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE)进程有明显的抑制作用,而CGA和BI没有明显抑制效果。实时荧光定量PCR检测结果显示,AMA和GCV处理可显著降低SGIV主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)和病毒囊膜蛋白(Viral protein VP088)的基因转录(P<0.05,下同)。蛋白印迹分析表明AMA和GCV对SGIV的MCP蛋白合成具有明显抑制效果。倒置荧光显微镜观察发现AMA和GCV处理明显减少感染过程中病毒加工厂的形成,提示AMA和GCV可能影响病毒装配。病毒滴度测定结果显示,AMA和GCV处理可显著降低SGIV感染过程中子代病毒的产量。【结论】应用SGIV体外感染模型筛选到的2种药物AMA和GCV具有一定的抗SGIV活性,且这种抗病毒能力主要通过抑制病毒的基因转录和蛋白合成,从而影响病毒的装配和产量。

• 鲤源高黏附力地衣芽孢杆菌HF-07107分离及其益生菌特性研究

  武婧玉, 陈永艳, 贾一然, 张晓彤, 冯军厂, 常绪路, 张建新,

  【目的】分离、鉴定鲤源高黏附力地衣孢杆菌菌株，并综合评价其作为鲤养殖饲料添加剂的潜力，为开发宿主源益生菌在鲤养殖中的应用提供参考。【方法】从健康鲤的肠道及其内容物中分离出潜在益生菌，根据形态学特征、生理生化特性、16S rRNA序列比对分析、菌株系统发育进化树构建等对分离菌株进行鉴定。通过检测分离菌株的自聚集能力、共聚集能力及其在有机溶剂中的疏水性评估其黏附能力，并通过测定菌株的耐酸、耐胆盐和耐高温能力，对嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌的抑菌能力及对抗生素药敏片的敏感性，明确其是否具有益生菌特性。【结果】从健康鲤的肠道及其内容物中分离出菌株HF-07107，形态学特征显示该菌株能产生芽孢、呈革兰氏阳性、杆状，其生理生化特征与地衣芽孢杆菌一致，其16S rRNA序列与地衣芽孢杆菌ATCC 14580T相似性为99.31%，且与地衣芽孢杆菌聚类在同一分支上，综合鉴定该菌株为地衣芽孢杆菌。菌株HF-07107自聚集能力最高达72.92%，与迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌的共聚集能力分别为96.15%和60.23%，在有机溶剂甲苯、二甲苯、三氯甲烷、正己烷中的疏水性值较高（90.00%以上），说明菌株HF-07107有高黏附力。同时，菌株HF-07107能耐受pH 2.0、0.3%胆盐浓度和90 ℃高温环境，抑制嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌的生长，对复方新诺明、丁胺卡那、环丙沙星、庆大霉素、红霉素、四环素、头孢唑林和诺氟沙星等8种抗生素敏感。【结论】鲤源潜在益生菌地衣芽孢杆菌HF-07107具有高黏附特性，能耐受不良环境，抑制病原菌生长，可作为宿主源益生菌应用于水产养殖。

• 玻璃轻石序批式生物膜反应器构建参数优化及水产养殖污水脱氮性能研究

  王年, 郁小娟, 骆楠, 王玲, 王昭玥, 肖冰冰, 陈俊律, 宋增福,

  【目的】探明玻璃轻石构建序批式生物膜反应器(SBBR)在水产养殖污水中的脱氮性能,为生物膜法处理水产养殖污水工艺中高效、低廉的载体材料选择提供模型及数据参考。【方法】以玻璃轻石为载体构建SBBR模型,利用水产养殖池底泥进行挂膜,并进行玻璃轻石不同孔径(3~8、2~3、1~2和0.1~1.0 mm)、粒径(10~20、20~30和30~50mm)和填充率(20%、30%和40%)脱氮性能优化试验,以获得最佳脱氮性能SBBR参数;以沸石、火山石、活性炭和SiO2颗粒为对照,对比各载体材料生物膜中的挥发性悬浮物(VSS)和细胞外聚合物(EPS)含量,比较不同载体材料对疏水性蛋白的吸附能力。【结果】玻璃轻石以孔径1~2 mm、粒径10~20 mm、填充率20%构建SBBR的除氮性能最优,第30 d时氨氮、亚硝氮和总氮的去除率分别可达(90.61±0.30)%、(99.45±0.08)%和(94.04±0.14)%,玻璃轻石上的VSS含量为3.87±0.11 g/L,EPS含量为80.99±0.05 mg/g-VSS,显著高于其他载体材料处理(P<0.05,下同),同时EPS中具有更高的蛋白/多糖(PN/PS)比值,有利于生物膜的形成;除氮细菌吸附试验结果,玻璃轻石可吸附(58.08±0.15)%的牛血清白蛋白(BSA),显著高于沸石(41.72±0.40)%、火山石(25.34±0.53)%、活性炭(20.68±0.13)%和SiO2颗粒(15.56±0.38)%。【结论】以玻璃轻石构建的SBBR应用于水产养殖污水处理具有良好的脱氮性能,且具有较好的除氮细菌吸附能力,是良好的生物膜技术修复水产养殖污水的载体材料。

• 不同饵料对中间球海胆摄食与生长及硫酸软骨素积累的影响

  张淑鑫, 崔东遥, 常亚青, 宋坚,

  【目的】明确海带、江蓠和石莼3种饵料对中间球海胆摄食、壳径增长、体质量增长、性腺颜色及硫酸软骨素积累的影响,为筛选适宜的养殖海胆饵料及合理制定鲜饵料匮乏期的中间球海胆投喂计划提供理论依据。【方法】将中间球海胆按投喂饵料分为海带投喂组、江蓠投喂组和石莼投喂组,在投喂第30、60和90 d,利用游标卡尺测定海胆壳径和壳高,使用天平测定海胆体质量和性腺重量,计算日平均摄食率、饵料系数、壳径特定生长率、体质量特定生长率和性腺指数;通过色度计测定性腺颜色并计算色差;采用酶联免疫分析法(ELISA)测定中间球海胆性腺硫酸软骨素含量和硫酸软骨素合酶活性。【结果】随着投喂时间的推移,各处理组中间球海胆的日平均摄食率呈下降趋势,江蓠投喂组日平均摄食率最高,其次是海带投喂组,石莼投喂组中间球海胆的日平均摄食率最低;在各时间段,饵料系数最高的是江蓠投喂组,其次是海带投喂组,最低的是石莼投喂组,且三者差异显著(P<0.05,下同);随投喂时间的推移,各处理组中间球海胆的壳径特定生长率和体质量特定生长率均呈下降趋势,在相同投喂时间下,各处理组的海胆壳径特定生长率和体质量特定生长率均差异显著,排序均为海带投喂组>石莼投喂组>江蓠投喂组;3个处理组的中间球海胆性腺指数存在一定差异,排序为海带投喂组>石莼投喂组>江蓠投喂组;江蓠投喂组和海带投喂组中间球海胆性腺颜色较优,江蓠投喂组性腺红度在各投喂时间段均最高,且在第90 d江蓠投喂组性腺黄度显著高于其余处理组,海带投喂组性腺亮黄色差在各投喂时间段均最低;江蓠投喂组的中间球海胆性腺硫酸软骨素含量和硫酸软骨素合酶活性最低,海带投喂组和石莼投喂组无显著差异(P>0.05)。【结论】不同饵料对中间球海胆摄食、壳径增长、体质量增长、性腺发育和品质及硫酸软骨素积累存在不同影响,在海带匮乏期可通过投喂石莼和江蓠进行有效补充,从而保障中间球海胆的生长和发育。

• 低氧和复氧对瘤背石磺肠道健康的影响

  蒋超, 王恺, 汤刘思巧, 唐少华, 李伟鹏, 孙梦颖, 土志涵, 沈和定,

  【目的】分析低氧和复氧对瘤背石磺肠道组织结构、能量代谢和微生物菌群的影响,探究其低氧抗逆和复氧恢复机制,为潮间带生物的抗逆及恢复机制研究提供理论参考。【方法】分别设常氧组(对照组)、低氧组和复氧组,在低氧胁迫4、8、12和24 h后复氧6、12、18、30和42 h,观察瘤背石磺肠道组织结构变化,测定乳酸含量、乳酸脱氢酶(LDH)和酸性磷酸酶(ACP)活性,同时分析肠道微生物群落变化情况。【结果】随着低氧胁迫时间的延长,瘤背石磺肠道组织中杯状细胞数量明显增加,至24 h时杯状细胞几乎遍布整个上皮层,复氧后逐渐恢复至正常水平。肠道组织的乳酸含量随低氧胁迫时间的延长呈上升趋势,LDH活性呈先升高后降低的变化趋势,分别在胁迫24和12h时达最高值,且与对照组间存在显著差异(P<0.05,下同),而ACP活性呈先升高后降低再升高的变化趋势,在8 h时降至最低值,且显著低于对照组;复氧后乳酸含量、LDH活性和ACP活性均有所恢复。肠道微生物菌群结构和菌落相对丰度因低氧条件而改变,门水平上优势菌群由对照组的厚壁菌门(Firmicutes)变化到变形杆菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和弯曲杆菌门(Campylobacterota);属分类水平上优势菌落从气单胞菌属(Aeromonas)变化到弧菌属(Vibrio),复氧后厚壁菌门(Firmicutes)又恢复优势地位;虽然复氧后菌落的相对丰度呈回升状态,但总体丰度仍低于对照组。LEfSe分析结果显示,对照组与低氧8 h组有20个显著差异群落,且主要集中在内生单胞菌属(Endozoicomonas)和弧菌属等;对照组与复氧组有39个显著差异群落,主要集中在黄杆菌科(Flavobacteriaceae)和幽门螺杆菌科(Helicobacteraceae)等。【结论】低氧影响瘤背石磺肠道组织结构,导致肠道菌群发生改变,进而影响肠道的抗氧化功能和非特异性免疫功能。

• 慢性氨氮胁迫对罗氏沼虾生长与存活及能量代谢的影响

  成良峰, 戴习林,

  【目的】阐明慢性氨氮胁迫对罗氏沼虾生长、存活和能量代谢的影响及其适应机制,为罗氏沼虾的健康养殖提供理论依据。【方法】设0.02mg/L(对照)、0.50mg/L(T0.50)、1.04mg/L(T1.04)、2.14mg/L(T2.14)、4.42mg/L(T4.42)和9.03 mg/L(T9.03)6个不同氨氮浓度处理组,养殖48 d,研究慢性氨氮胁迫对罗氏沼虾摄食、生长、存活及血清供能物质含量和能量代谢相关酶活力的影响。【结果】T9.03组的罗氏沼虾存活率显著低于对照组(P<0.05,下同),其他胁迫组的存活率与对照组无显著差异(P>0.05,下同);摄食率、饵料效率及增重率、相对增长率和特定生长率均随着氨氮浓度的增加呈降低趋势,饵料系数和体重差异系数均随着氨氮浓度的增加呈上升趋势;血清葡萄糖(Glu)含量随着氨氮胁迫时间的延长总体上呈先升高后降低的变化趋势;在胁迫12 d后,血清甘油三酯(TG)和总胆固醇(TCHO)含量均随着氨氮浓度的增加呈下降趋势;在胁迫前24d,各胁迫组的血清总蛋白(TP)含量与对照组均无显著差异,而在第48 d,胁迫组的TP含量随着氨氮浓度的增加呈降低趋势,且除T0.50组外,其他胁迫组均显著低于对照组;血清乳酸(LA)含量随着氨氮浓度的增加总体上呈上升趋势。此外,胁迫组的肝胰腺己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)及乳酸脱氢酶(LDH)活力均随着胁迫时间的延长呈先升高后降低的变化趋势;磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(PEPCK)活力在第12~48 d均有胁迫组显著高于对照组;在整个氨氮胁迫期间,琥珀酸脱氢酶(SDH)活力均随着氨氮浓度的增加呈降低趋势,T4.42和T9.03组的活力均显著低于对照组。【结论】氨氮对罗氏沼虾的最大无影响浓度为0.50mg/L;罗氏沼虾为应对慢性长期较高浓度的氨氮胁迫,能量供应和利用途径均发生明显变化,最终显著影响其摄食、生长和存活,造成养殖效果不佳。在集约化养殖中,应及时关注养殖水体的氨氮含量,减少氨氮胁迫对罗氏沼虾造成的额外耗能,提高生产效益。

• 不同卵巢成熟率下克氏原螯虾形态性状对体质量的影响

  袁畅, 李蔚, 郑玉斯, 李鑫, 张圣杰, 彭金霞, 李文红, 何苹萍, 王大鹏,

  【目的】确定不同卵巢成熟率克氏原螯虾群体形态性状对体质量的影响,为克氏原螯虾选育工作提供参考。【方法】以晒田环境胁迫方式获得不同卵巢成熟率的克氏原螯虾群体,分别测量不同卵巢成熟率群体的全长(X1)、体长(X2)、头胸甲长(X3)等11个形态性状及体质量(Y);通过相关分析、通径分析和多元回归分析研究不同卵巢成熟率下克氏原螯虾群体体质量与主要形态性状间关系的变化。【结果】通过晒田环境胁迫方式确定3个卵巢成熟率51.67%(S1+S2)、76.67%(S3)和96.67%(S4)克氏原螯虾群体。相关分析结果表明,不同卵巢成熟率群体各形态性状与体质量存在显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)差异,体质量变异系数均在25.00%以上,选育潜力较大。通径分析结果表明,3个卵巢成熟率群体的总决定系数均≥0.850,51.67%卵巢成熟率群体体质量(Y)由全长(X1)、螯足长(X5)和腹全长(X8)共同决定;76.67%卵巢成熟率群体体质量由头胸甲长(X3)、头胸甲宽(X4)和螯钳长(X6)共同决定;96.67%卵巢成熟率群体体质量由全长(X1)和螯钳宽(X7)共同决定。3个卵巢成熟率克氏原螯虾群体形态性状与体质量的多元回归方程分别为:YS1+S2=-34.028+0.301X1+0.320X5+0.256X8；YS3=-34.142+0.645X3+0.835X4+0.261X6；YS4=-45.899+0.553X1+1.493X7。【结论】随着晒田时间的增加,克氏原螯虾卵巢成熟率随之升高,卵巢成熟率为51.67%时,显著影响体质量的主要形态性状以螯足长为主,腹全长和全长为辅;卵巢成熟率升至76.67%时,显著影响体质量的主要形态性状以头胸甲长为主,头胸甲宽和螯钳长为辅;卵巢成熟率升至96.67%时,显著影响体质量的主要形态性状以全长为主,螯钳宽为辅。

• 急性氨氮胁迫对三湖慈鲷幼鱼行为学的影响

  符娟娟, 张春暖, 孙如意, 徐明嘉, 程银峰, 陈万光,

  【目的】分析急性氨氮胁迫对三湖慈鲷幼鱼焦虑行为、聚群行为和趋光行为的影响，为三湖慈鲷养殖业的健康发展、观赏鱼行为学研究及科学管理提供参考依据。【方法】使用3个浓度（0、5.00和12.25 mg/L NH4Cl）氨氮胁迫三湖慈鲷幼鱼，观察分析其在不同氨氮浓度水体中的焦虑行为（潜伏时长、穿越鱼缸水平中线总次数和待在鱼缸上半部总时间）、聚群行为（延迟离开鱼群穿越鱼缸垂直中线所需时间、转换次数和远离鱼群总时间）和趋光行为（单尾幼鱼在鱼缸不同亮度区域的停留时间和多尾幼鱼在鱼缸不同亮度区域的停留数量）。【结果】焦虑行为试验结果显示，随着氨氮胁迫浓度的升高，三湖慈鲷幼鱼第一次穿越鱼缸水平中线的潜伏时间明显缩短，穿越鱼缸水平中线的次数显著增加（PP>0.05），说明三湖慈鲷幼鱼具有明显的负趋光行为。【结论】水体氨氮胁迫浓度为5.00和12.25 mg/L时，三湖慈鲷幼鱼均表现出焦虑行为和离群行为，尤其是氨氮浓度在12.25 mg/L时表现更焦虑；当水体中氨氮浓度为5.00 和12.25 mg/L时，三湖慈鲷幼鱼的负趋光性未受明显影响。因此，建议三湖慈鲷幼鱼人工饲养水体的氨氮浓度不宜超过5.00 mg/L。

• 5-羟色胺对瘤背石磺低氧胁迫的调节作用

  唐少华, 李伟鹏, 蒋超, 汤刘思巧, 王恺, 沈和定,

  【目的】分析外源5-羟色胺(5-HT)对低氧胁迫瘤背石磺(Onchidium reevesii)氧化应激水平和存活率的影响,探究5-HT在瘤背石磺应对低氧胁迫的调控作用。【方法】分别利用免疫组化和实时荧光定量PCR检测瘤背石磺体内5-HT含量和5-羟色胺受体基因(5-HTR)的相对表达量;采用酶联免疫吸附(ELISA)和实时荧光定量PCR检测瘤背石磺血淋巴中5-HT含量及各组织5-HTR基因的相对表达量。比较低氧胁迫期间(0、3、6、9、12和24 h)瘤背石磺存活率;通过注射5-HT及磷酸盐缓冲溶液(PBS)分析瘤背石磺在低氧胁迫下应激相关酶活性及表达量差异。【结果】5-HT及其受体在瘤背石磺肝胰腺、胃、性腺、肠道、腹足和肌肉中均有分布。受到低氧胁迫的影响,5-HTR基因在各组织中相对表达量也发生改变,随着低氧胁迫时间的延长,5-HTR基因高相对表达量组织从腹足、肠道、胃变为性腺组织。低氧胁迫下瘤背石磺血淋巴中5-HT产生响应,其含量先下降—上升—下降的变化趋势。注射5-HT使瘤背石磺在低氧胁迫时有更好的存活表现,在低氧刺激9 h后,注射5-HT组的瘤背石磺存活率高于注射PBS处理和低氧处理。用5-HT刺激瘤背石磺低氧胁迫9 h后发现,注射外源5-HT可降低瘤背石磺氧化应激水平,提高其抗氧化酶活性和表达量及总抗氧化能力。【结论】瘤背石磺受低氧胁迫后,其体内5-HT及其受体会产生响应,参与生理调节;注射外源5-HT可提高瘤背石磺的低氧耐受能力和存活率。

• 池塘循环流水养殖模式对罗非鱼不同部位肌肉品质的影响

  马之瑞, 陈丽婷, 严欣, 郭忠宝, 伍宜杰, 罗立鸣, 张文超, 何智昌, 肖俊, 罗永巨,

  【目的】为探究罗非鱼在池塘循环流水养殖(In-pond raceway system,IPRS)模式下其肌肉各营养指标的变化,明确该养殖模式对罗非鱼肌肉品质的影响,为池塘循环流水养殖模式的推广及开展高品质罗非鱼养殖提供科学依据。【方法】以IPRS养殖的罗非鱼为试验组,传统池塘养殖(Traditional pond aquaculture,TPA)罗非鱼为对照组,对2种养殖模式下罗非鱼背肌、腹肌和尾肌的营养指标及背肌的质构特性和肌纤维特性进行测定分析。【结果】IPRS组罗非鱼腹肌粗蛋白(19.62%)和背肌粗脂肪(3.30%)含量最高,IPRS组和TPA组背肌中粗脂肪含量差异显著(P<0.05,下同);在IPRS组和TPA组各部位肌肉中均检测出16种氨基酸,必需氨基酸总量、鲜味氨基酸总量及16种氨基酸总量在IPRS组背肌中最高(7.41%、7.22%和18.41%),在TPA尾肌中最低(6.09%、5.89%和15.20%);IPRS组和TPA组4种鲜味氨基酸中谷氨酸和天冬氨酸含量分别排第1和第2,含量最高在IPRS组背肌(3.11%和2.05%);IPRS组腹肌饱和脂肪酸总量显著降低,不同部位肌肉的多不饱和脂肪酸总量均极显著提高(P<0.01),多不饱和脂肪酸总量在IPRS组尾肌最高(31.53%),在TPA组背肌最低(27.99%)。IPRS组罗非鱼硬度、弹性、咀嚼性和回复性等肌肉质构特性相对于TPA组分别提高24.89%、18.19%、61.40%和33.63%;且IPRS组肌纤维直径更小、密度更大。【结论】池塘循环流水养殖罗非鱼的肌肉品质与营养价值相比于传统池塘养殖罗非鱼更具优势。

• 生态因子对雷州湾海域鱼类重要种分布影响的量化评价

  陈志劼, 刘伟豪, 潘士远, 王学锋, 吕少梁,

  【目的】量化生物及非生物生态因子对雷州湾海域鱼类重要种分布的影响,厘清鱼类对各种变量变动的响应,为今后预测该海域渔业资源的丰度变动及基于群落视角的渔业管理和研究提供实例。【方法】根据2018—2020年每年春、秋季于雷州湾开展的底拖网鱼类调查数据,先利用相对重要性指数(IRI)筛选出生态鱼类重要种,用于构建联合物种分布模型(JSDMs);进而结合冗余分析(RDA)进行验证,以量化评价生态因子对鱼类重要种种群分布的作用。【结果】2018—2020年在雷州湾逐年春、秋两季调查共捕获鱼类217种,其中17种鱼类(IRI≥100)为生态重要种;构建的联合物种分布模型较好地反映了鱼类实际分布(后验拟合效果R2=0.46);环境因子对雷州湾海域鱼类重要种的分布影响最大(达61.3%),其中溶解氧(DO)的作用最大(DO=4.39~10.36,21.6%),而不同鱼类对不同生态因子的耐受性或其栖息地偏好也是导致分布年际波动的原因之一;总体上,种间作用对鱼类分布的影响相对较小(38.7%),但对部分鱼类如条纹叫姑鱼(Johnius fasciatus,84.5%)、皮氏叫姑鱼(Johnius belangerii,73.0%)和棕斑兔头鲀(Lagocephalus spadiceus,60.9%)等的分布起着决定性作用。【结论】环境因子主要影响雷州湾鱼类的分布,不同鱼类因环境耐受或生境偏好存在明显的年际差异;种间作用对鱼类分布的影响相对较小,但对部分鱼类如条纹叫姑鱼、皮氏叫姑鱼和棕斑兔头鲀等起关键性作用。

• 日本蓝鳍金枪鱼养殖业发展战略分析及对我国的启示

  张溢卓, 杨子江, 于书洲,

  【目的】借鉴日本蓝鳍金枪鱼养殖业发展经验，为推动我国金枪鱼养殖业发展，探索强化我国高经济价值水产品供给能力及相关鼓励政策制定提供参考。【方法】梳理国际蓝鳍金枪鱼供需情况，分析日本主导蓝鳍金枪鱼市场的内因和具体路径，运用战略研究方法厘清日本科技助力产业发展的系列举措。【结果】日本是世界主要金枪鱼养殖基地之一，也是最早开发蓝鳍金枪鱼养殖技术的国家，截至2022年日本有88个经营主体、187个养殖场和1379个养殖网箱，年产量达21460 t。日本通过产出制度、科技创新、种业提升和出口中国等战略，主导蓝鳍金枪鱼养殖产业全球供需对接，提高了日本蓝鳍金枪鱼国际话语权，推进了沿岸渔村振兴。“十四五”时期，我国将发展蓝鳍金枪鱼产业定位为战略性新兴产业，系统打造金枪鱼全产业链新业态。中国水产科学研究院积极拓展深远海养殖空间，在黄鳍金枪鱼养殖方面积累了一定经验，正在全力推进蓝鳍金枪鱼养殖业发展，近几年南海金枪鱼养殖技术取得突破进展。【建议】我国应在海南、广东和浙江等现有国家级海洋牧场示范区利用现有科技和蓝鳍金枪鱼生息水域等优势；应进一步加大国际科技创新合作与交流，推动中日共同开发蓝鳍金枪鱼消费市场。建立健全与国际渔业管理规则相适应的管理制度，完善蓝鳍金枪鱼管理法规和政策措施，出台系列配套政策保驾护航。