南方农业学报杂志

南方农业学报杂志2024年第4期

• 香港牡蛎cyclin B基因组织表达特征及其多克隆抗体制备

  邱衡通, 许贵林, 李宛怡, 周齐家, 刘小宁, 朱俊霖,

  【目的】明确香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)B型细胞周期蛋白基因(cyclin B)组织表达特征,并通过原核表达融合蛋白制备多克隆抗体,为探究香港牡蛎cyclin B基因在环境胁迫下的表达特征及揭示cyclin B调控贝类细胞周期的作用机制提供理论依据。【方法】克隆香港牡蛎cyclinB基因c DNA序列,通过SignalP-5.0、ProtParam、TMHMM2.0、NetSurfP2.0及Bioedit7.0等软件进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR检测cyclinB基因在香港牡蛎不同组织中的表达情况;构建重组质粒pET32a-cyclin B并运用原核表达系统诱导表达融合蛋白,经Ni-NTA镍离子亲和层析柱纯化后免疫BALB/c小鼠制备鼠源多克隆抗体,然后以间接ELISA检测多克隆抗体效价、Western blotting检测多克隆抗体特异性。【结果】香港牡蛎cyclinB基因cDNA序列全长2353bp,包括1299bp的开放阅读框(ORF)、103 bp的5'非编码区(5'-UTR)和951 bp的3'非编码区(3'-UTR),共编码432个氨基酸残基。香港牡蛎cyclin B蛋白相对分子量为49.13 kD,理论等电点为7.16,不含信号肽和跨膜结构域。香港牡蛎cyclin B氨基酸序列包含2个保守的周期蛋白框,与来自同属的长牡蛎cyclin B氨基酸序列相似性最高(98.8%),基于cyclin B氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示香港牡蛎与长牡蛎的亲缘关系最近。cyclin B基因在香港牡蛎的闭壳肌、外套膜、性腺、鳃、唇瓣、消化腺等组织中均有表达,以性腺中的相对表达量最高,显著高于其他组织中的相对表达量(P<0.05)。通过原核表达获得的融合蛋白cyclin B具备良好免疫原性,且主要以包涵体形式存在;以其免疫BALB/c小鼠制备出的鼠源多克隆抗体效价大于1∶64000,能特异识别香港牡蛎性腺中的cyclin B蛋白。【结论】香港牡蛎cyclin B基因具有较高的保守性,其氨基酸序列包含2个保守的周期蛋白框;香港牡蛎cyclin B基因表达具有广谱性和组织差异性,在调控生殖细胞减数分裂过程中发挥作用。通过原核表达体系及免疫注射BALB/c小鼠制备获得的cyclin B鼠源多克隆抗体具有高效价,能特异识别香港牡蛎性腺中的cyclin B蛋白,为进一步探究香港牡蛎cyclin B的生物学功能与表达调控机理提供了技术支持。

• 不同种植模式对栝楼根际土壤微生物群落多样性的影响

  徐筋燕, 何晓兰, 邵明灿, 万云龙, 郭万君, 施苏配, 杨中海, 潘明如, 郭书巧,

  【目的】分析不同种植模式对栝楼根际土壤理化性质和土壤微生物群落多样性的影响,为探索合理有效的栝楼连作障碍消减策略提供理论依据。【方法】设连作(对照)、连作—翻耕—种植新苗和栝楼—水稻轮作3种种植模式,测定不同种植模式下栝楼根际土壤理化性质及土壤微生物群落结构和多样性并对比其差异,采用典型相关分析探明土壤理化性质与微生物群落结构的相关性。【结果】栝楼—水稻轮作和连作—翻耕—种植新苗2种模式下,栝楼根际土壤有机碳、全氮、全磷、碱解氮和速效磷含量显著高于对照(P<0.05,下同)。高通量测序结果表明,连作—翻耕—种植新苗模式能显著增加栝楼根际土壤细菌群落多样性和丰度,但真菌群落丰度和多样性与对照无显著差异(P>0.05),栝楼主要致病相关真菌属壳多孢菌属(Stagonosporopsis)和炭疽菌属(Colletotrichum)的相对丰度仍保持在较高水平;栝楼—水稻轮作模式可显著降低土壤真菌群落丰度和多样性,降低壳多孢菌属和炭疽菌属等有害真菌属相对丰度。典型相关分析结果表明,不同种植模式下土壤微生物群落存在明显差异,土壤有机碳含量、全氮、全磷、全钾、碱解氮、速效钾和速效磷含量能显著影响栝楼根际土壤细菌和真菌物种分布。【结论】栝楼—水稻轮作能提高土壤质量,降低土壤真菌群落丰度和多样性,降低有害真菌属相对丰度,该种植模式对栝楼连作障碍的缓解效果优于连作—翻耕—种植新苗模式。

• 烟秆炭基肥对植烟土壤氮组分及微生物群落结构的影响

  刘东明, 郭宇轩, 童晨晓, 魏圆慧, 杨曦, 毛艳玲,

  【目的】研究不同用量烟秆炭基肥对植烟土壤氮组分及微生物群落结构的影响，以期为烟秆炭基肥在农业生产中的应用及植烟土壤氮素固持提供科学依据。【方法】采用田间试验，设对照（CK，不施肥）、烟草专用肥（F，750 kg/ha）、低量烟秆炭基肥（LBF，525 kg/ha）、中量烟秆炭基肥（MBF，1050 kg/ha）和高量烟秆炭基肥（HBF，1575 kg/ha）共5个处理，其中MBF与F处理的氮（N）、磷（P）、钾（K）养分含量相同。烟叶成熟期采集表层土壤样品测定土壤氮含量、酶活性及微生物相关指标，分析不同用量烟秆炭基肥处理对土壤有机氮和无机氮含量、土壤氮循环酶活性及微生物群落结构的影响。【结果】与CK相比，施用烟秆炭基肥显著提高了土壤的全氮、可溶性有机氮、颗粒有机氮及铵态氮含量（PMBF>LBF>F>CK，LBF、MBF和HBF处理的微生物量氮含量较F处理分别提高31.83%、44.32%和59.84%。施用烟秆炭基肥增加了土壤细菌群落丰富度和多样性，且与施用量有关，其中HBF处理的Chao1指数和Shannon指数最高，较CK分别显著提高4.38%和5.92%，较F处理分别显著提高2.68%和3.46%。施用烟秆炭基肥也影响了细菌群落组成，与CK相比，LBF、MBF和HBF处理的变形菌门（Proteobacteria）相对丰度降低11.14%~15.16%，放线菌门（Actinobacteria）相对丰度提高6.50%~10.89%，根微菌属（Rhizomicrobium）相对丰度提高177.00%~203.00%。冗余分析结果表明，土壤全氮、可溶性有机氮、颗粒有机氮和铵态氮含量及脲酶和过氧化氢酶活性与放线菌门、单糖菌门（Saccharibacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）呈正相关，与变形菌门、绿弯菌门（Chloroflexi）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）呈负相关。【结论】施用烟秆炭基肥可提高土壤氮组分含量，调节细菌群落结构，以中、高量烟秆炭基肥处理效果较优。同等肥力下，施用烟秆炭基肥的效果优于烟草专用肥。在实际生产中考虑到生产成本及施用效果，以中量烟秆炭基肥处理（1050 kg/ha）较适合。

• 广西南亚热带不同森林类型土壤细菌群落多样性及其与土壤化学性质相关分析

  杨希妤, 田湘, 吴庆标,

  【目的】探究不同森林类型土壤细菌群落的多样性和组成,以及土壤细菌群落与土壤因子间的相关性,为掌握华南地区森林生态系统土壤细菌群落结构提供参考依据。【方法】采用高通量测序技术结合土壤理化性质试验,对土壤细菌群落结构进行分类鉴定,测定土壤pH、含水率、有机质(OM)、碱解氮(AN)、速效磷(AP)、速效钾(AK)、钙(Ca)、镁(Mg)、总酚、复合态酚及水溶性酚等理化指标;分析桉树林、马尾松林、马尾松石栎针阔混交林及桂花林土壤细菌群落多样性差异。【结果】通过测序从4种森林类型土壤样品中共得到内生细菌有效序列731289条,注释得到6320个操作分类单元(OTUs),共有2界36门85纲116目136科152属57种。其中,优势细菌门分别是变形菌门(Proteobacteria,33.16%)、放线菌门(Actinobacteria,30.24%)、酸杆菌门(Acidobacteria,16.83%)及绿弯菌门(Chloroflexi,6.71%),优势菌属分别是红游动菌属(Rhodoplanes,7.72%)、分枝杆菌属(Mycobacterium,2.82%)、Candidatus_Solibacter(1.57%)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium,0.91%)及伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia,0.67%)。不同森林生态系统中,桂花林的土壤细菌群落丰富度和多样性均最高,其次是桉树林和马尾松林,针阔混交林最低。冗余分析结果显示pH(r=0.943)、AK(r=0.861)对细菌群落结构均有极显著影响(P<0.01),其中,细菌在门分类水平上影响程度排序依次为p H>AK>复合态酚>总酚>Ca>Mg>AP>水溶性酚>OM>AN,在属分类水平上排序依次为pH>AK>Ca>Mg>AP>总酚>复合态酚>AN>水溶性酚>OM。【结论】4种森林类型土壤细菌群落多样性和丰度受土壤化学性质中pH和AK影响最大,部分门分类水平细菌受土壤酚类物质的影响较大。

• 辣椒根际土壤细菌群落与理化性质互作分析

  罗路云, 王殿东, 赵志祥, 廖静静, 江波, 张卓,

  【目的】分析辣椒根际土壤细菌群落与理化性质的互作,为科学防治辣椒土传病害和辣椒高产优质栽培提供参考依据。【方法】以辣椒苗期、花期和坐果期根际土壤(分别标记为SD、FR和FT)为研究对象,测定3组土壤样本中pH、有机质、总氮、碱解氮、总磷、有效磷、总钾和有效钾含量,采用Illumina HiSeq 2500测序平台进行高通量测序,分析辣椒不同生育期根际土壤细菌Alpha多样性指数及门和属分类水平上相对丰度,通过主坐标分析(PCoA)和基于Bray_Curtis距离的细菌群落不相似性检验,分析辣椒不同生育期根际土壤细菌与理化因子的相关性。【结果】随着辣椒生长,SD、FR和FT三者间的pH和碱解氮含量2个指标具有显著差异(P<0.05,下同);3个生育期土壤细菌的Alpha多样性指数和丰富度、Chao1指数均无显著差异(P>0.05);SD中特有操作分类单元(OTUs)数目最多;3个生育期土壤中变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和蓝细菌门(Cyanobacteria)均属于优势菌门;SD根际土壤中链霉菌属(Streptophyta)、嗜酸菌属(Acidovorax)、亚硝化球菌属(Nitrososphaera)和Gp6相对丰度较高,FR根际土壤中链霉菌属、亚硝化球菌属(Nitrososphaera)和红游动菌属(Rhodoplanes)的相对丰度较高,FT以链霉菌属和Trinickia为主。主坐标分析(PCoA)和不相似性检验结果显示,不同生育期根际土壤样本细菌群落之间差异显著。相关分析结果显示,土壤pH和碱解氮与细菌群落呈极显著正相关(P<0.01)。【结论】辣椒根际土壤理化性质及细菌群落结构因生育期不同存在差异,pH和碱解氮是影响细菌群落变化的关键因子。

• 广西小花老鼠簕可培养细菌多样性及促生、防病、产酶活性分析

  殷豆豆, 黄宏智, 宋超东, 刘睿, 梁颖, 陆君铭, 谢俊杰, 阎冰, 申乃坤, 张红岩,

  【目的】分析广西小花老鼠簕可培养细菌多样性及促生、防病、产酶活性,为小花老鼠簕种群恢复及筛选可利用菌种资源提供参考依据。【方法】采用稀释涂布法对小花老鼠簕根、茎、叶及根际土壤可培养细菌进行分离、纯化;对菌株的16S rRNA序列进行PCR扩增,测序结果经EzBioCloud比对确定菌株的分类地位;通过功能培养基对菌株的促生溶磷、固氮、产吲哚乙酸(IAA)和分泌铁载体、防病(香蕉枯萎病)及产酶(蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶)活性进行分析。【结果】从小花老鼠簕根、茎、叶及根际土壤共筛选获得细菌159株,根据菌落形态及16S rRNA测序结果排除重复后为65株,隶属于8目7科14属,其中芽孢杆菌属(Bacillus)为优势菌属,占分离菌株的64.62%,同时发现1株潜在新种(Gxun-T66),与已发现菌株相似性仅为98.49%;植物促生防病活性结果显示,溶磷菌株34株、固氮菌株31株、产IAA菌株20株、分泌铁载体菌株17株,其中北澳伯克霍尔德氏菌(Burkholderia territorii)Gxun-T33的溶磷和分泌铁载体能力最强;29株对香蕉枯萎病尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f. sp. Cubense)有明显抑制作用,其中暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)Gxun-T25的抑菌效果最好,抑菌率达69.67%;产酶活性结果显示,产蛋白酶菌株56株,产淀粉酶49株,产纤维素酶48株,同时产3种酶活性的菌株有34株,占分离菌株的52.31%。【结论】红树植物小花老鼠簕富含微生物资源且具备促生、防病及产酶活性,同时发现1株潜在新种。

• 硒砂瓜根系不同生态位细菌群落多样性及结构分析

  朱滕滕, 岳思君, 谢志鹏, 王国琴, 郑蕊, 苏建宇,

  【目的】分析硒砂瓜根系不同生态位细菌群落结构及多样性,为了解硒砂瓜根系微生物组成规律,挖掘微生物资源,维持硒砂瓜根系土壤健康及微生物生态系统稳定提供理论参考。【方法】采用五点取样法采集根围、根际、根表和根内4个生态位土壤样品,分别标记为SRW、SRJ、SRB和SRN,通过使用Illumina Miseq测序平台对硒砂瓜根系不同生态位细菌群落进行解析,探究硒砂瓜细菌群落Alpha多样性指数,包括Sobs、Shannon、Simpson、Chao1和ACE指数,比较各生态位及内生菌与硒砂瓜根系其他生态位在门和属分类水平上的细菌物种差异,并进行主坐标分析(PCoA)及溯源分析。【结果】土壤中(SRW、SRJ及SRB)细菌群落Sobs、Shannon、ACE和Chao1指数均显著高于内生菌群落(SRN)(P<0.05,下同),多样性即Shannon和Simpson指数排序为SRJ>SRW>SRB>SRN,丰富度即ACE和Chao1指数排序为SRW>SRJ>SRB>SRN。硒砂瓜根系不同生态位细菌类群的优势门均为变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteriota),各生态位变形菌门占比59.59%~84.62%,4个生态位的优势属均为根瘤菌属(AllorhizobiumNeorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和固氮菌属(Azotobacter),根瘤菌属占比5.48%~15.68%。PCoA结果显示,硒砂瓜根系不同生态位的群落结构存在显著差异(R2=0.6651,P=0.001)。根系各生态位相对丰度前15的物种中,10个细菌门和8个细菌属的相对丰度存在显著差异。内生菌与硒砂瓜根系其他生态位相对丰度前15的物种中,8个细菌门和5个细菌属的相对丰度存在显著差异。溯源分析结果发现根际细菌群落中有55.70%来源于根围细菌,根表细菌群落中有65.75%来源于根际细菌,根内细菌群落中有90.75%来源于根表细菌,表明硒砂瓜根系不同生态位细菌群落来源之间存在一定相关性。【结论】宁夏硒砂瓜根系不同生态位细菌群落组成丰富,相对丰度有差异且细菌群落来源具有一定相关性,不同生态位对细菌群落具有选择及过滤作用。

• 光叶苕子内生真菌分离鉴定及其对香蕉枯萎病的生防和促生潜力

  阮彦楠, 番华彩, 王禹童, 付利波, 郑泗军, 毛俊, 李舒, 王志远,

  【目的】筛选对香蕉枯萎病具有生防和促生潜力的内生真菌,为香蕉枯萎病的生物防治提供参考依据和潜力菌株。【方法】以香蕉枯萎病菌尖孢镰刀菌4号生理小种热带型(F. oxysporum f. sp. cubense tropical race 4,Foc TR4)为靶标菌,以光叶苕子(Vicia villosa var.)根内分离纯化的内生真菌为试验菌株,采用平板对峙法评价内生真菌对Foc TR4的平板抑制效果;结合形态学与分子生物学方法确定拮抗真菌的分类地位,通过扫描电镜观察拮抗真菌对Foc TR4菌丝形态的影响;并通过平板溶磷圈法、平板固氮圈法和CAS平板法检测拮抗真菌解无机磷、固氮和产铁载体能力;通过盆栽试验验证拮抗真菌对香蕉枯萎病的防治效果及对香蕉的促生效果。【结果】从光叶苕子根部分离纯化得到8株拮抗真菌,其中201、204和401号菌株的抑菌效果最好,经形态学与分子生物学方法分别鉴定为螺卷毛壳菌(Chaetomium cochliodes)、简青霉菌(Penicillium simplicissimum)和蓝状菌(Talaromyces oumae-annae)。平板对峙显示201号菌株对Foc TR4的体外抑制率最高,达74.39%,其次是401号菌株,为71.00%,204号菌株的抑制率为69.83%。扫描电镜观察结果表明3株拮抗真菌均能抑制Foc TR4菌丝生长并导致菌丝畸形,交联变形,且孢子数聚集增多,菌丝明显肿胀,节间缩短,分枝增多,菌丝粗糙,尖端扩张,呈泡状并断裂。204和401号菌株在功能平板上还具有一定的促生潜力,具有解无机磷、固氮和产铁载体能力。盆栽试验结果表明,3株拮抗真菌201、204和401号菌株均对Foc TR4具有较强的抑制活性,并对香蕉枯萎病表现出较好的防治效果,对球茎的防治效果分别为90.625%、65.623%和96.876%,对叶片的防治效果分别为90.745%、90.743%和90.750%,同时,3株拮抗真菌都能在一定范围内减少Foc TR4对香蕉生长的抑制作用,从而促进香蕉植株生长。【结论】从光叶苕子根部分离获得的3株拮抗真菌201、204和401号菌株对香蕉枯萎病菌均有较好的拮抗效果,能抑制香蕉枯萎病菌的毒害,促进香蕉植株生长,具有良好的生防和促生潜力。

• 种植抗异丙隆转基因水稻和施用异丙隆对转基因水稻根际微生物群落的影响

  苏湘宁, 李传瑛, 刘雪松, 章玉苹,

  【目的】明确种植抗异丙隆转基因水稻和施用除草剂异丙隆对转基因水稻根际微生物群落的影响,为抗异丙隆水稻种植的生态风险评价提供科学依据。【方法】基于盆栽试验,采用高通量测序技术分析2个抗异丙隆转基因水稻株系及其亲本和施用异丙隆转基因在不同水稻生长阶段的根际微生物群落多样性与组成的差异。【结果】高通量测序结果显示,在水稻所有生长阶段,变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadota)、拟杆菌门(Bacteroidota)和粘球菌门(Myxococcota)是根际微生物中的优势细菌门;罗兹菌门(Rozellomycota)、子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)和被孢霉门(Mortierellomycota)是根际微生物中的优势真菌门。在水稻相同生长阶段,无论是种植抗异丙隆转基因水稻、非转基因水稻还是施用除草剂异丙隆,水稻根际微生物群落的丰富度指数、辛普森多样性指数和香农多样性指数均未受到显著影响(P>0.05,下同);抗异丙隆转基因水稻、施用异丙隆的转基因水稻与非转基因水稻根际微生物中多数优势微生物门类相对丰度无显著差异,个别优势微生物门在水稻特定的生长阶段发生变化。基于相对丰度前15位微生物属的聚类分析显示,在水稻某些生长阶段根际微生物群落的组成在抗异丙隆转基因水稻、施用异丙隆的转基因水稻与非转基因水稻间存在一定差异。根际微生物群落的主成分分析显示,抗异丙隆转基因水稻、施用异丙隆的转基因水稻和非转基因水稻根际微生物群落组成间无显著差异,但不同生长阶段的根际微生物群落组成出现空间分异。根际微生物群落变差分解分析显示,水稻生长阶段对根际土壤中的细菌群落结构变化的影响为45.62%,而品种和施用异丙隆对根际土壤中细菌群落结构变化的影响分别为1.15%和2.76%;水稻生长阶段对根际土壤中真菌群落结构变化的影响为48.36%,而品种和施用异丙隆对根际土壤中真菌群落结构变化的影响分别为1.36%和2.45%。【结论】种植抗异丙隆转基因水稻和施用异丙隆并未对转基因水稻根际微生物群落产生显著影响,但根际土壤中的细菌和真菌群落一定程度上受水稻生长阶段的影响。

• 火龙果茎溃疡病植株茎组织细菌群落特征分析

  梁洲勇, 姚姿婷, 曹雪颖, 韦增亭, 赵渊, 朱桂宁, 邹承武,

  【目的】比较火龙果健康植株与溃疡病植株茎组织的内生细菌群落特征和功能差异,为揭示火龙果溃疡病发生机制和研究防治技术提供理论依据。【方法】采集火龙果健康植株和溃疡病植株茎组织,利用Illumina Miseq测序平台对植株茎组织内生细菌的16S rDNA序列进行测定,分析健康植株与罹病植株茎组织中的细菌群落特征差异。【结果】火龙果健康植株茎组织的细菌群落种类和扩增子序列变体(Amplicon sequence variant,ASV)数均低于罹病植株;健康植株与罹病植株茎组织的细菌群落多样性无显著差异(P>0.05)。在细菌优势门中,罹病植株茎组织的放线菌门(Actinobacteriota)、绿弯菌门(Chloroflexi)和异球菌门(Deinococcota)相对丰度较高,而健康植株茎组织的拟杆菌门(Bacteroidota)相对丰度较高。罹病植株茎组织的优势细菌属有27个,其中假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、异球菌属(Deinococcus)、梭菌属(Clostridium_sensu_stricto_1)、短小杆菌属(Curtobacterium)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、毛梭菌属(Lachnoclostridium)、微枝形杆菌属(Microvirga)、溶杆菌属(Lysobacter)、Klenkia和类芽孢杆菌属(Paenibacillus)相对丰度较高。健康植株茎组织的优势细菌属有26个,其中绒毛杆菌科未分类属(norank_f_Muribaculaceae)、拟杆菌属(Bacteroides)、乳杆菌属(Lactobacillus)、甲基杆菌属群(Methylobacterium-Methylorubrum)、黄单胞菌科未知属(unclassified_f_Xanthomonadaceae)、副杆菌属(Parabacteroides)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、红球菌属(Rhodococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、放线杆菌属(Acinetobacter)和纤维弧菌属(Cellvibrio)的相对丰度较高。线性判别分析(LEfSe)结果显示,健康植株茎组织具有较多指示菌群,而罹病植株茎组织的指示细菌属只有4个不同的属,分别是黄单胞菌属、短小杆菌属、毛梭菌属和新鞘氨醇单胞菌属(Novosphingobium)。细菌功能预测结果显示,溃疡病植株茎组织内生细菌在膜转运、碳水化合物代谢、其他氨基酸代谢和其他次级代谢产物的生物合成等4个二级功能层中的基因拷贝数显著高于健康植株茎(P<0.05)。【结论】火龙果发生茎溃疡病后其茎组织细菌群落多样性无明显改变,但部分优势菌属的比例发生明显改变,其中4个指示细菌属可能与溃疡病发生有关。

• 三七叶际微生物的分离鉴定及生防功能研究

  禄蓉, 张秀, 田光祥, 陈朝苍, 赵云思, 朱书生, 杨敏,

  【目的】从三七叶际分离筛选对三七叶部黑斑病病原菌具有较强抑制效果的生防菌株,为开发安全高效的生防菌剂提供菌种资源,也为中药材病害的生态防控提供新思路。【方法】采用连续稀释法从1年生健康三七叶片中分离可培养叶际微生物,通过平板对峙法测定分离菌株对三七叶部黑斑病菌人参链格孢菌(Alternaria panax)菌株SL17的拮抗效果,筛选对人参链格孢菌具有生防作用的叶际微生物菌株,结合ITS和16S rDNA测序对活性菌株进行分类鉴定,挑选抑菌效果最佳的菌株进一步进行广谱抑菌能力测定。【结果】从健康三七叶际共分离纯化得到125株分离物,通过平板对峙法从中筛选获得50株对人参链格孢菌具有明显抑制效果的拮抗菌株,其中26株为真菌,24株为细菌。26株拮抗真菌中,2株三七叶内生真菌菌株NZ-14和NZ-23的抑菌效果最佳,其中康氏木霉菌(Trichoderma koningii)菌株NZ-14可完全抑制人参链格孢菌菌丝生长,抑制率达100.00%;24株拮抗细菌中,2株三七叶内生细菌菌株NX-20和NX-23的抑菌效果最佳,其中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株NX-20对人参链格孢菌的抑制率达71.13%。叶际拮抗菌对三七主要病原菌抑制活性测定结果显示,菌株NZ-14、NZ-23、NX-20和NX-23对槭菌刺孢菌(Mycocentrospora acerina)菌株DMS5、茄腐镰刀菌(Fusarium solani)菌株F3、锈腐菌(Cylindrocarpon destructans)菌株RS006均具有良好的抑制能力,抑制率为39.26%~78.97%。【结论】三七叶际存在大量具有潜在抑菌能力的微生物,其中2株木霉菌菌株NZ-14、NZ-23和2株芽孢杆菌菌株NX-20、NX-23的抑制效果最好,对三七叶部和根部主要病害病原菌均有较强的抑制作用,可作为三七病害生物防控的微生物资源。

• 月季炭疽病内生拮抗细菌的筛选鉴定及抑菌作用

  巫瑞, 袁美静, 康晓玲, 杜重阳, 孙瑞瑞, 丁传雨, 杜丽,

  【目的】发掘月季内生拮抗细菌资源,为月季炭疽病生物防治提供高效而稳定的拮抗菌株资源。【方法】以20个健康无病害蔷薇属植物的叶片为试验材料,采用组织匀浆法分离叶片内生细菌,采用平板对峙法筛选对月季炭疽病病原菌(Colletotrichum fructicola)YJY-20具有拮抗作用的内生细菌菌株,结合菌落形态、生理生化和16S rRNA序列分析对拮抗菌进行种类鉴定。利用平板对扣法测定拮抗菌挥发性有机化合物的拮抗效果;利用牛津杯扩散法测定拮抗菌无菌发酵液对炭疽病病原菌及菌丝的影响;通过PCR扩增脂肽类抑菌物质合成基因;采用琼脂孔扩散法测定拮抗菌粗蛋白和脂肽类抑菌物质的抑菌活性;利用平板检测法测定拮抗菌产胞外酶活性;通过平板对峙法测定拮抗菌对12种植物病原真菌的抑制效果;采用离体叶片试验测定拮抗菌发酵液对月季炭疽病的防治效果。【结果】从蔷薇属植物叶片中分离筛选出2株对菌株YJY-20具有较强拮抗效果的内生细菌DMGSMG4和QZM1,经鉴定分别为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis)。菌株DMGSMG4和QZM1的挥发性有机化合物对菌株YJY-20的抑制率分别为11.72%和30.71%,同时能减少病原菌黑色素生成;其无菌发酵液对菌株YJY-20的抑制率分别为60.25%和61.24%,并能造成病原菌菌丝断裂扭曲。菌株DMGSMG4和QZM1粗蛋白对菌株YJY-20的抑制率分别为59.76%和50.63%,且热稳定性较好;其脂肽类抑菌物质对菌株YJY-20的抑制率分别为50.07%和45.03%。2株拮抗菌均能扩增出bmyB、fenD、srfAA和srfAB脂肽类抑菌物质合成相关基因。2株拮抗菌可产纤维素酶和蛋白酶,其中菌株DMSGMG4还可产有机酸。菌株DMGSMG4和QZM1对12种植物病原真菌的抑制率均大于50.00%,其对月季炭疽病离体叶片防治率分别为59.35%和20.58%。【结论】筛选获得的菌株DMGSMG4和QZM1对炭疽病病原菌具有较强的拮抗效果,具有作为月季炭疽病生防菌株的潜力。

• 基于iTRAQ蛋白质组学的OsAAP6不同转基因水稻胚乳差异蛋白筛选

  彭波, 孙晓宇, 邱静, 彭娟, 赵强, 孙艳芳, 宋晓华, 张志国, 周伟, 汪全秀,

  【目的】基于iTRAQ蛋白质组学筛选不同OsAAP6转基因水稻胚乳的差异蛋白,明确胚乳中的差异蛋白,以期为后续利用OsAAP6基因提升稻米的营养品质提供理论依据。【方法】以水稻OsAAP6超量表达阳性OX(+)和阴性对照OX(-)材料及OsAAP6互补表达阳性ZpZc(+)和阴性对照ZpZc(-)为试验材料,采用同位素标记相对与绝对定量(iTRAQ)技术对其进行蛋白质组学检测分析,并利用考马斯亮蓝G-250法对其胚乳中的4类储藏蛋白(谷蛋白、醇溶蛋白、清蛋白和球蛋白)进行含量检测。【结果】与ZpZc(-)和OX(-)转基因阴性对照相比,ZpZc(+)和OX(+)转基因阳性胚乳中OsAAP6基因的表达量分别在P<0.01和P<0.001水平极显著升高。与ZpZc(-)和OX(-)转基因阴性对照相比,ZpZc(+)和OX(+)转基因阳性水稻共有58种差异蛋白共同上调或下调表达,其中有39种蛋白显著增加(P<0.05,下同),有19种蛋白显著降低。在39种共同上调表达的蛋白中有27种蛋白参与水稻种子储藏底物的合成与积累,且有16种上调表达蛋白参与种子储藏蛋白的代谢和积累。与ZpZc(-)和OX(-)转基因阴性对照相比,ZpZc(+)和OX(+)转基因阳性水稻胚乳中的谷蛋白、醇溶蛋白、清蛋白和球蛋白含量均显著增加。【结论】OsAAP6基因上调表达,能抑制与支链淀粉合成相关蛋白的积累,但能促进其胚乳中储藏蛋白的积累,进而提高胚乳中谷蛋白、醇溶蛋白、清蛋白和球蛋白含量,可用于高蛋白水稻新品种的分子育种和遗传改良。

• 抗稻瘟病水稻恢复系的分子标记辅助选育及抗性鉴定

  孙富, 唐梅, 卢宏琮, 何聪, 廖张波,

  【目的】开展抗稻瘟病水稻恢复系的分子标记辅助选育及抗性鉴定,为育成持久、广谱抗病优质杂交水稻新品种提供优异的遗传资源和技术参考。【方法】利用分子标记辅助选择和回交育种技术,将持久、广谱的抗稻瘟病基因Pi1、Pi2和Pigm导入恢复系桂R1703,获得了单基因、双基因和三基因导入系,并对其进行稻瘟病鉴定和农艺性状调查,分析不同抗稻瘟病基因间的抗性效应及抗性基因导入对受体亲本农艺性状的影响。【结果】通过对杂交后代和回交群体的Pi1、Pi2和Pigm基因相关分子标记检测,发现抗稻瘟病基因Pi1、Pi2和Pigm已成功导入到桂R1703中,筛选获得7个携带有抗稻瘟病基因且抗性和农艺性状综合表现优良的导入株系,表现出较强的稻瘟病抗性。单基因导入系中,抗稻瘟病基因的抗性效应排序为为Pigm>Pi2>Pi1;双基因和三基因导入系的稻瘟病抗性均强于单基因导入系,尤其以三基因导入系抗性最强,不同基因聚合的抗性效应排序为Pi1+Pi2+Pigm>Pi2+Pigm>Pi1+Pigm>Pi1+Pi2。7个瘟病抗性基因导入株系与桂R1703在穗长和千粒重方面无显著差异(P>0.05,下同),有2个瘟病抗性基因导入系的株高显著高于桂R1703(P<0.05,下同);有1个瘟病抗性基因导入系的单株有效穗显著高于桂R1703;有3个瘟病抗性基因导入系的单穗总粒数显著高于桂R1703;有5个瘟病抗性基因导入系结实率显著低于桂R1703;有2个瘟病抗性基因导入系的单株产量显著低于桂R1703;有4个瘟病抗性基因导入系的单株产量显著高于桂R1703。【结论】通过分子标记辅助选育可有效聚合多基因(Pi1、Pi2和Pigm基因),使恢复系桂R1703的稻瘟病抗性得到明显提升,获得一系列抗稻瘟病且与亲本其他性状相近的遗传材料,可作为亲本材料用于选育抗病优质的杂交稻。

• 钩藤UrTSA基因克隆及组织表达特异性分析

  章瑶, 穆德添, 王丽娅, 陆英, 唐其, 朱丽娜,

  【目的】克隆钩藤碱的合成关键酶即色氨酸合成酶α链基因(UrTSA),并分析其组织表达特异性,为探究该基因的钩藤碱生物合成机制提供理论参考。【方法】从生物项目数据库(BioProject)筛选得到钩藤碱的生物合成相关酶基因UrTSA,以钩藤的根、叶、茎钩和蒴果的cDNA为模板,PCR克隆UrTSA基因的开放阅读框(ORF),并进行生物信息学分析,结合实时荧光定量PCR检测UrTSA基因在钩藤不同组织中的表达模式。【结果】UrTSA基因的ORF为963bp,编码320个氨基酸残基,相对分子量为33924.49Da,理论等电点(pI)为9.11,不稳定指数Ⅰ为33.50,脂溶指数为102.12,总平均亲水性指数为0.117,说明UrTSA蛋白为稳定、脂溶性好的疏水蛋白。UrTSA蛋白亚细胞定位于叶绿体,不含信号肽和跨膜区,为非分泌型蛋白;不具有潜在的糖基化位点,有30个潜在的磷酸化位点,包括16个丝氨酸(Ser)、13个苏氨酸(Thr)和1个酪氨酸(Tyr);二级结构由α-螺旋(43.44%)、无规则卷曲(31.87%)、延伸链(15.94%)和β-折叠(8.75%)组成。UrTSA蛋白与其他11个植物物种的TSA蛋白具有较高的氨基酸序列相似性(69.78%~92.77%),其中与阿拉比卡咖啡(Coffee arabica)和欧基尼奥伊德斯种咖啡(Coffea eugenioides)TSA蛋白的亲缘关系较近。UrTSA基因在钩藤的根、叶、茎钩和蒴果中均有表达,其中在蒴果、根和叶中相对表达量均极显著高于茎钩中的相对表达量(P<0.01),分别是茎钩的2.17、1.58和1.20倍。【结论】UrTSA基因具有组织表达特异性,主要在蒴果钩藤碱合成中发挥调控作用,为后续研究钩藤碱在钩藤中不同部位的累积及其生物合成途径提供思路和线索。

• 云南西双版纳澳洲坚果开花与结实特性

  孔广红, 余文才, 李玲, 陶丽, 贺熙勇,

  【目的】对云南西双版纳地区的澳洲坚果开花结实特性展开观测及分析,为澳洲坚果高产优质提供理论依据。【方法】以12个澳洲坚果品种为观测对象,采用挂牌记录法观察其开花物候及坐果规律,以坐果率、坐果花序率、每果序平均坐果数、落果率等参数为评价指标,分析澳洲坚果不同品种的结实特性。【结果】不同澳洲坚果品种的开花物候复杂多样,品种D4、O.C、863、820和842花期较长,分2批次开花;品种A16、A4、Special、828、816、508和246的花期较短且较集中。受花期和品种特性共同影响,澳洲坚果不同品种的坐果率、坐果花序率、每果序平均坐果数及落果率存在明显差异,品种O.C、828、863和D4的第2批次末花期花序几乎没有坐果能力。所有参试品种的最终坐果率与最终坐果花序率呈正相关,可使用坐果花序率代替坐果率评价产量。花期对不同品种每果序最终平均坐果数量的影响不大,每个果序上仅1~2个果实。所有参试品种均存在严重的落果现象,但同一花期不同品种的落果率差异不显著(P>0.05)。【结论】根据开花物候决定采收模式,花期长的品种D4、O.C、863、820和842需分批次采收,花期短的品种A16、A4、Special、828、816、508和246可集中采收。根据第2批次末花期花序几乎无坐果能力的结实特性,可疏除2批次开花品种O.C、863、828和D4的第2批次末花期刚萌发的花序,节约母树资源。

• 不同套种模式对油茶幼林土壤理化性质及酶活性的影响

  秦维, 曾维军, 刘燕, 罗文敏, 刘盈盈, 贺红早,

  【目的】研究不同套种模式对油茶幼林土壤理化性质及酶活性的影响,为筛选出适宜推广的油茶幼林经营模式及合理施肥提供理论依据。【方法】以2017年种植的油茶幼林为试验地,2021—2023年连续分别套种黄豆、花生、玉米、箭舌豌豆、辣椒,以油茶纯林为对照(CK),测定土壤理化性质及酶活性等指标,计算单项及综合肥力指数。【结果】不同套种模式的油茶根围土壤有机质含量以套种花生最高,比CK提高119.80%,套种辣椒土壤有机质含量最低,比CK提高74.54%;全氮含量最高是箭舌豌豆,是CK的3.92倍,最低是玉米,是CK的2.88倍;碱解氮含量排序为箭舌豌豆>花生>黄豆>玉米>辣椒>CK,其含量在54.68~153.56 g/kg;全磷和有效磷含量最低的是辣椒,分别是CK的2.33和1.06倍。套种花生的有效铜、有效锰、有效锌含量均高于其他套种模式,且显著高于CK(P<0.05,下同);套种玉米的有效铁含量显著高于其余模式;套种箭舌豌豆的有效硼含量显著高于其余模式。油茶根围土壤酸性磷酸酶(ACP)活性以箭舌豌豆最高,是CK的2.88倍;土壤过氧化氢酶(CAT)活性以花生最高,是CK的2.32倍;各套种模式间的土壤蔗糖酶(SC)和脲酶(UE)活性差异不显著(P>0.05),但均与CK差异显著。不同套种模式土壤综合肥力指数排序依次为花生>箭舌豌豆>黄豆=玉米>辣椒>CK,花生的土壤综合肥力等级评价为Ⅱ级,其他套种模式均为Ⅲ级。【结论】油茶套种花生对改善土壤理化性质及酶活性的效果最好,综合肥力指数最高,是适合喀斯特地区推广的套种模式。

• 扬州城市森林负氧离子分布变化特征及其与气象因素的关系

  连经纬, 邢玮, 万欣, 葛之葳, 何冬梅,

  【目的】分析扬州城市森林空气负氧离子浓度时空变化特征及其与气象因素的关系,为了解扬州城市森林空气负氧离子资源情况提供理论依据。【方法】依托江苏扬州城市森林生态系统国家定位观测研究站,以宋夹城体育休闲公园(城市森林)、茱萸湾风景区(城市近郊森林)和润扬湿地森林公园(城市远郊森林)为研究对象,收集3个区域的2020年1—12月空气负氧离子浓度和林内气象数据,比较不同季节之间负氧离子浓度的差异,分析负氧离子浓度与气象因素的相关性,并利用增强回归树分析各气象因素对负氧离子浓度的贡献率,结构方程模型分析各气象因素对负氧离子的直接和间接影响。【结果】扬州地区城市近郊森林区的空气负氧离子浓度日变化呈单峰型;城市近郊森林区与城市远郊森林区月变化趋势较一致,峰值分别出现在4月和6月。城市近郊森林区不同季节平均负氧离子浓度表现为春季>冬季>夏季>秋季,城市远郊森林区平均负氧离子浓度表现为夏季>冬季>春季>秋季。城市远郊森林区林内负氧离子浓度年平均值(666.87个/cm3)和郁闭度(0.80)低于城市森林区和城市近郊森林区,且森林郁闭度越高其负氧离子浓度的变异系数越小。城市森林区空气负氧离子浓度与风速、气压、空气温度和PM2.5存在显著(P<0.05,下同)或极显著(P<0.01,下同)相关性,城市近郊森林区和城市远郊森林区的空气负氧离子浓度与气压、风速、空气温度、空气湿度、PM2.5、光照强度等林内气象因素存在显著或极显著相关性。选择城市远郊森林区进行气象因素对空气负氧离子浓度的贡献率以及结构方程模型分析,结果表明空气湿度在春季(38.51%)和秋季(47.58%)对空气负氧离子浓度的贡献最大,而PM2.5在夏季(27.87%)和冬季(38.51%)对空气负氧离子的贡献最大;空气湿度对负氧离子浓度有直接正向影响,而光照强度对负氧离子浓度有直接负向影响,风向通过改变PM2.5对负氧离子浓度产生间接影响。【结论】扬州不同区域森林的负氧离子浓度变化规律不尽相同,不同季节和时间对空气负氧离子浓度有明显影响。根据不同区域的负氧离子浓度差异及其表现出的季节变化规律可制定不同的公园游览计划,建议夏季前往城市远郊森林区,春季前往城市近郊森林区游览。

• 热处理时间对牡丹籽油理化性质及抗氧化活性的影响

  崔彩芳, 孙兆岳, 王云富, 徐奔, 陈富春, 沈维军, 万发春, 程安玮,

  【目的】研究比较微波和烘烤预处理对牡丹籽油理化性质及抗氧化活性的影响,以期为牡丹籽油的制备及品质控制提供科学指导。【方法】采用微波(700 W,0.5、1、1.5、2 min)和烘烤(120℃,10、20、30、40 min)对油用牡丹籽进行预处理后分离牡丹籽油,以未经任何预处理为对照,分析2种方式的处理时间对牡丹籽油理化性质(提油率、水分及挥发物、酸值、碘值等)和抗氧化活性的影响。【结果】经微波和烘烤处理后的牡丹籽油总提取率均有所增加,在微波2 min和烘烤30 min时增加幅度最大,分别提高9.44%和12.08%。在微波处理下,随着处理时间的延长,牡丹籽油的酸值、水分及挥发物含量、多酚含量及抗氧化活性均呈下降趋势,多酚和水分及挥发物含量在微波处理2 min时最低,分别为2.52μg/mL和11.59%;但碘值、2-硫代巴比妥酸(TBA)值和p-茴香胺值表现出明显增加趋势,TBA值和p-茴香胺值在微波处理2 min时达最大值,分别为261.39和2.14,皂化值呈先上升后趋于平缓的变化趋势。在烘烤处理下,随着处理时间的延长,牡丹籽油的酸值和水分及挥发物含量明显增加,而碘值、皂化值、TBA值和p-茴香胺值呈降低趋势,酸值在烘烤40 min时达最高值(162.28 mg/g),在10 min时碘值和皂化值达峰值,分别为147.96 g/100 g和173.35 mg/g;多酚含量和抗氧化活性呈先上升后下降的变化趋势,在烘烤20 min时最高,多酚含量为5.25μg/mL。【结论】微波和烘烤预处理均对牡丹籽油的理化性质及抗氧化活性产生明显影响,且2种处理方式的影响效果具有明显差异性。综合考虑,油用牡丹籽微波预处理在700 W下以1.5~2 min适宜,烘烤预处理在120℃下以20~30 min适宜。

• 微波辅助提取美藤果蛋白工艺优化及性质研究

  鲁正丽, 李云嵌, 陈云走, 张应菊, 孙健, 张雪春, 方越,

  【目的】优化美藤果蛋白的提取工艺,并研究其加工性质,为美藤果蛋白的精深加工利用提供参考依据。【方法】以脱脂美藤果饼为原料,采用微波辅助碱溶酸沉法提取美藤果蛋白(记为MAPP),在单因素试验基础上,以液料比(A)、微波功率(B)和微波时间(C)为自变量,MAPP得率(Y)为响应值,通过响应面法优化其提取工艺,同时探究不同温度和pH对其加工性质的影响,并与碱溶酸沉法提取的美藤果蛋白(记为APP)进行比较。【结果】3个因素对MAPP得率的影响排序为微波功率>液料比>微波时间,其中微波功率影响极显著(P<0.01,下同),3个交互项影响均不显著(P>0.05),模型优化方程为Y=14.42+0.5075A+1.05B+0.4838C+0.0425AB+0.4225AC-0.1350BC-1.25A2-1.13B2-0.8725C2,得到MAPP提取的最佳工艺条件:液料比17∶1(mL/g)、微波功率645 W、微波时间62 s,在此条件下蛋白得率为14.46%,蛋白纯度为90.29%,高于APP得率(13.24%)。60℃热处理可增强美藤果蛋白的溶解性,50℃时持水率和持油率最大;当pH为2或9时,美藤果蛋白有较高的溶解性,且其起泡性及起泡稳定性、乳化性及乳化稳定性均为最高;相较于APP,在60和70℃时,MAPP的溶解性和持水性极显著提高,20~60℃范围内MAPP的持油率均高于APP,pH为4~7时MAPP溶解性极显著提高;在适当pH条件下起泡性及起泡稳定性、乳化性及乳化稳定性均得到改善。【结论】微波辅助碱溶酸沉法可提高美藤果蛋白得率,改善其加工性质。

• 山东烤烟水溶性糖和Amadori化合物组成特征及其对感官质量的影响

  任明波, 李静, 马志远, 戴华伟, 高峰, 邱军, 庞雪莉,

  【目的】明晰山东烤烟上、中2个部位B2F、C3F烟叶中水溶性糖和Amadori化合物组分构成及含量分布特征,分析化合物对烤烟感官质量的影响,为改进和精准调控山东烤烟感官品质提供数据支持。【方法】选取山东主产区生产的烤烟B2F和C3F叶片为试验材料,利用气相色谱—质谱联用技术(GC-MS)和高效液相色谱—三重四极杆串联质谱技术(HPLC-MS/MS)对烤烟中水溶性糖和Amadori化合物进行分析,通过正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)方法对B2F和C3F烟叶样品进行判别分析,并对卷烟样品进行评吸,通过相关分析揭示与山东烤烟各感官质量指标呈正/负相关的关键化学成分。【结果】定性定量分析山东烤烟中16种水溶性糖和8种Amadori化合物,其中葡萄糖和果糖含量较高,蔗糖次之,其余水溶性糖含量较低;B2F和C3F烟叶间阿拉伯糖醇、阿洛酮糖和甘露醇含量差异显著(P<0.05,下同),C3F烟叶的阿拉伯糖醇含量是B2F烟叶的1.50倍,B2F烟叶的阿洛酮糖和甘露醇含量分别是C3F烟叶的1.26和48.85倍;B2F和C3F烟叶中主要Amadori化合物均为1-脱氧-1-L-脯氨酸-D-果糖(Fru-Pro)(14~45 mg/g),其次为1-脱氧-1-L-丙氨酸-D-果糖(Fru-Ala)、1-脱氧-1-L-谷氨酸-D-果糖(Fru-Glu)、1-脱氧-1-L-苯丙氨酸-D-果糖(Fru-Phe)、葡糖胺(GLU)和1-脱氧-1-L-色氨酸-D-果糖(Fru-Trp)(1~20 mg/g)。挖掘出对B2F和C3F烟叶区分贡献较大的化合物,按贡献大小排序为甘露醇>阿洛酮糖>核糖醇>来苏糖>核糖>1-脱氧-1-L-缬氨酸-D-果糖(Fru-Val)>GLU>果糖>Fru-Ala。C3F烟叶各感官质量指标得分均明显高于B2F烟叶。在B2F烟叶中,阿拉伯糖醇、Fru-Pro、阿拉伯糖、木糖醇、阿洛酮糖和Fru-Ala与部分感官评吸指标呈显著或极显著(P<0.01,下同)正相关,Fru-Glu和GLU与部分感官评吸指标呈显著或极显著负相关。在C3F烟叶中,核糖、阿洛酮糖、果糖、葡萄糖和麦芽糖与部分感官评吸指标呈显著或极显著正相关,来苏糖、核糖醇、Fru-Glu和Fru-Phe与部分感官评吸指标呈显著或极显著负相关。【结论】山东烤烟水溶性糖和Amadori化合物的含量在部位间差异明显,进而对烟叶感官质量产生不同的影响。

• 红鲫胚胎发育过程中Sox8基因对壬基酚胁迫的响应

  张琼宇, 彭娟, 田雨苏, 孙远东,

  【目的】明确红鲫SRY相关高迁移率族盒蛋白8基因(Sox8)表达模式及壬基酚(NP)暴露对红鲫胚胎发育过程中Sox8基因表达的影响,为揭示NP胁迫下红鲫胚胎发育畸形的分子机制提供科学依据。【方法】运用RACE克隆红鲫Sox8基因cDNA全长序列,通过ProtParam、ProtScale、InterPro、PredictProtein、DeepTMHMM等在线软件进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR检测红鲫Sox8基因在各成体组织及不同胚胎发育阶段的表达情况,以及不同浓度NP暴露对红鲫胚胎期Sox8基因表达的影响。【结果】红鲫Sox8基因c DNA序列全长2163 bp,其开放阅读框(ORF)1176bp,共编码391个氨基酸残基;红鲫SOX8蛋白相对分子量为43798.30Da,理论等电点(pI)为6.90,脂溶指数为49.92,不稳定指数为66.04,总平均亲水性指数(GRAVY)为-1.026,其N端含有Sox_N二聚化结构域和HMG-box结构域;基于SOX8氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树显示红鲫与鲫的亲缘关系最近。红鲫Sox8基因在各成体组织中广泛表达,以脑组织中的Sox8基因相对表达量最高,显著高于其他组织(P<0.05,下同);在红鲫胚胎发育过程中,Sox8基因的表达从受精后到14体节期呈逐渐下降趋势,但从21体节期开始Sox8基因相对表达量显著增高,直到孵化期始终维持在较高水平。在大多数情况下,NP暴露能显著影响红鲫胚胎发育过程中Sox8基因的表达,特别是14体节期后的发育阶段,NP暴露主要是不同程度地激活Sox8基因表达。【结论】Sox8基因表达在红鲫成体中具有组织特异性,且在胚胎发育过程中呈先降低后升高的变化趋势。NP暴露能显著影响红鲫胚胎发育过程中Sox8基因的表达,14体节期后Sox8基因表达水平升高可能是NP致畸红鲫胚胎的重要原因之一。

• 味觉受体T1R1和T1R3在从江香猪附睾不同区段的差异表达

  蒙利洁, 黄梦婷, 徐永健, 冯贤辀, 刘文娇, 龚婷,

  【目的】明确从江香猪附睾中不同区段味觉受体T1R1和T1R3的定位及表达情况,为揭示猪附睾不同区段形成特殊微环境保障精子成熟的作用机制提供参考依据。【方法】采集初情期(30d)和性成熟期(180d)从江香猪附睾组织样品,分别采用实时荧光定量PCR、免疫组织化学、蛋白免疫印迹(Western blotting)等检测从江香猪附睾不同区段味觉受体T1R1和T1R3的定位及表达情况。【结果】味觉受体T1R1/T1R3的编码基因TAS1R1/TAS1R3均表现为附睾Ⅳ区的相对表达量显著高于其他区段(P<0.05,下同),而Ⅰ区的相对表达量显著低于其他区段,具体排序为Ⅳ区>Ⅴ区>Ⅱ区> Ⅲ区>Ⅰ区。免疫组织化学定位分析结果显示,在从江香猪附睾不同区段均检测到T1R1/T1R3不同程度的免疫阳性信号。其中,T1R1在附睾Ⅰ区主要定位于肌样细胞层与基细胞核;在附睾Ⅱ区主要定位于附睾上皮细胞、肌样细胞和精子细胞;在附睾 Ⅲ 区强烈定位于附睾管腔和微绒毛根部;附睾 Ⅳ区为5个区段中表达最强烈的部位,定位于附睾管腔精子、管腔内缘和狭窄细胞膜上;在附睾Ⅴ区主要定位于附睾间质组织和狭窄细胞膜上。T1R3定位于附睾Ⅰ区血管内皮细胞、脱落生精细胞和附睾上皮细胞(尤其是基细胞);在附睾II区的精子、晕细胞和狭窄细胞上有较强表达;在附睾 Ⅲ区和 Ⅳ区主要定位于空泡化的附睾上皮细胞;在附睾Ⅴ区定位于附睾管不规则处和空泡化附睾上皮细胞,其表达强度仅次于 Ⅲ区。Western blotting检测结果显示,从江香猪附睾Ⅳ区的T1R1/T1R3表达水平最高,其次是Ⅱ区,二者显著高于其他区段。【结论】初情期从江香猪附睾T1R1和T1R3的表达具有区段特异性和细胞特异性,以Ⅳ区的表达水平最高,且主要定位于附睾上皮细胞顶端、狭窄细胞和微绒毛根部,提示T1R1/T1R3在建立促进猪附睾精子成熟和储存的特殊腔内微环境中发挥重要作用。

• 中国大鲵组织蛋白酶D基因克隆及其表达特征分析

  商文聪, 彭国玲, 黎琴容, 苏淑贤, 白禹, 李灿,

  【目的】明确组织蛋白酶D基因(CTSD)在中国大鲵不同组织中的表达模式及其免疫防御功能,为深入探究大鲵抵抗病原入侵的作用机理提供理论依据。【方法】通过RACE克隆中国大鲵CTSD基因cDNA序列,采用ProtParam、SignalP-5.0、TMHMM 2.0、CELLO、NetPhos 3.1及NetNGlyc 1.0等在线软件进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR检测健康中国大鲵不同组织及嗜水气单胞菌感染后的CTSD基因表达情况。【结果】中国大鲵CTSD基因cDNA序列全长1992bp,包括1197bp的开放阅读框(ORF)、136bp的5'端非编码区(5'-UTR)和659bp的3'端非编码区(3'-UTR),共编码398个氨基酸残基。中国大鲵CTSD蛋白相对分子量为43 kD,理论等电点(pI)为6.07,属于酸性稳定疏水性蛋白,主要定位于溶酶体,具有跨膜结构和信号肽,包含1个典型的天冬氨酸蛋白酶结构域和2个天冬氨酸蛋白酶活性位点,以及3个N-糖基化位点(131Asn、222Asn和249Asn)和33个潜在的磷酸化位点。中国大鲵CTSD氨基酸序列与东北小鲵CTSD氨基酸序列的相似性最高,达88.68%;基于CTSD氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示中国大鲵与东北小鲵的亲缘关系最近。CTSD基因在健康中国大鲵的肺脏、肌肉、皮肤、肾脏、肝脏、脾脏、心脏、胃、脑和肠道等10个组织中均有表达,且以肺脏、肌肉、肠道和脾脏中的相对表达量较高;嗜水气单胞菌感染后72 h,中国大鲵肾脏和肝脏中的CTSD基因相对表达量极显著升高(P<0.01,下同),分别是对照组的13.88和35.67倍;脾脏和皮肤中的CTSD基因相对表达量显著升高(P<0.05),分别是对照组的5.43和1.74倍;肌肉中的CTSD基因相对表达量则在感染后12 h极显著升高至最高值,是对照组的42.96倍。【结论】中国大鲵CTSD氨基酸序列具有高度的保守性,包含1个典型的天冬氨酸蛋白酶结构域和2个天冬氨酸蛋白酶活性位点;CTSD基因呈组成性表达,可能在中国大鲵抗病原菌入侵的免疫反应中发挥作用。

• 中华鳖IGF2和IGF2R基因克隆及其功能研究

  曾丹, 李林, 严峰, 陈欣成, 吴成瑶, 李菁菁, 涂洋洋, 王晓清,

  【目的】探索胰岛素样生长因子2基因(IGF2)和胰岛素样生长因子2受体基因(IGF2R)在中华鳖生长过程中发挥的作用,为揭示IGFs系统在中华鳖异速生长及两性生长差异中的作用机制打下基础。【方法】采用RACE克隆中华鳖IGF2和IGF2R基因c DNA序列,利用BioEdit、ExPASy、TMHMM Server v2.0、SignalP及SMART等在线软件进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR分析IGF2和IGF2R基因在雌雄中华鳖不同组织、不同表型及不同性类固醇激素处理下的表达变化。【结果】中华鳖IGF2基因cDNA序列全长1180 bp,共编码222个氨基酸残基;IGF2蛋白相对分子量为24.84 kD,理论等电点(pI)为9.00,属于跨膜蛋白,含有1个IIGF结构域。中华鳖IGF2R基因cDNA序列全长8765bp,共编码2443个氨基酸残基;IGF2R蛋白相对分子量为271.92kD,pI为5.64,属于跨膜蛋白,含有14个重复的CIMR结构域和1个FN2结构域。基于IGF2和IGF2R氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树均显示,中华鳖与龟鳖类的亲缘关系最近,与鱼类和两栖动物的亲缘关系相对较远。IGF2和IGF2R基因在中华鳖体内具有广泛的组织表达谱,IGF2基因在精巢中的相对表达量显著高于卵巢(P<0.05,下同),IGF2R基因则恰好相反。IGF2基因在成年中华鳖生长快个体肝脏中的相对表达量显著高于生长慢个体,IGF2R基因的表达模式则相反。在雌二醇(E2)处理下,除雌性中华鳖肝脏中的IGF2R基因相对表达量在注射6 h时显著升高外,IGF2和IGF2R基因在雌雄个体肝脏中的相对表达量整体上呈下降趋势;MT处理对雄性个体肝脏中IGF2基因的表达无显著影响(P>0.05),但在注射48 h后显著提高雌性个体肝脏中的IGF2基因相对表达量,且显著下调雌性中华鳖肝脏中的IGF2R基因相对表达量。【结论】IGF2和IGF2R基因参与调控中华鳖性腺的发育及成熟,且IGF2R可能通过内化降解IGF2而对中华鳖的生长起负调控作用。此外,IGF2和IGF2R基因会通过下调表达量来响应外源激素的刺激,进而实现对中华鳖生长的调控。

• 盐度和亚硝酸盐氮慢性胁迫对凡纳滨对虾生长、抗氧化及免疫的影响

  王林薇, 程曦, 甘宏宽, 戴习林,

  【目的】分析盐度和亚硝酸盐氮慢性胁迫对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)生长、抗氧化及免疫的影响,探究凡纳滨对虾应对环境胁迫的调控机制,为其健康养殖提供理论依据。【方法】以凡纳滨对虾(平均体长5.20±0.67 cm,平均体质量2.01±0.73 g)为试验材料,设计双因素试验,盐度为0.5‰、1.0‰和3.0‰,亚硝酸盐氮浓度为0.07、0.20、0.50、1.50、4.00和10.90 mg/L,共18个处理组,进行30 d胁迫试验,测定凡纳滨对虾生长性能指标、肝胰腺和鳃组织酶活性及抗氧化与免疫相关基因相对表达量并进行TUNEL检测。【结果】凡纳滨对虾存活率、体长日增长值和体质量日增长值在相同盐度下均随着亚硝酸盐氮浓度的升高总体呈下降趋势,在相同亚硝酸盐氮浓度下随着盐度的升高总体呈上升趋势;肝胰腺和鳃的总抗氧化能力(T-AOC)及过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性与锰型超氧化物歧化酶基因(Mn-sod)、CAT基因、GPx基因、细胞色素氧化酶基因(CytC)、细胞凋亡因子Caspase-3基因(CASP3)和抗菌肽基因(Crustin)相对表达量在相同盐度下均随着亚硝酸盐氮浓度的升高呈先上升后下降的变化趋势,在相同亚硝酸盐氮浓度下随着盐度的升高总体呈上升趋势。TUNEL检测结果显示,凡纳滨对虾肝细胞凋亡率随着亚硝酸盐氮浓度的增加呈上升趋势。盐度和亚硝酸盐氮的交互作用对凡纳滨对虾的存活率、体长日增长值及体质量日增长值均无显著影响(P>0.05),但对肝胰腺和鳃组织的T-AOC及CAT、GPx活性与Mnsod、CAT、GPx、CytC、CASP3、Crustin相对表达量均有极显著影响(P<0.01)。【结论】抗氧化酶(CAT和GPx)及抗氧化与免疫相关基因(Mn-sod、CAT、GPx、CytC、CASP3和Crustin)参与凡纳滨对虾在盐度和亚硝酸盐氮胁迫下的应答过程,盐度和亚硝酸盐氮的变化会引起凡纳滨对虾氧化应激反应,胁迫程度较轻时,机体通过增加抗氧化酶活性并上调抗氧化与免疫相关基因协同应对外界恶劣环境;但随着胁迫程度加强,酶活性和基因相对表达量下降,诱导细胞凋亡发生,对肝胰腺和鳃造成损伤,影响正常生理功能,最终导致凡纳滨对虾死亡。

• 克氏原螯虾Dmrt1基因克隆及表达特征分析

  陆专灵, 纪月鑫, 戴龙喜, 王大鹏, 郭忠宝, 肖俊, 梁正, 黄彬胜, 杨冬玲, 韦友传,

  【目的】克隆克氏原螯虾(Procambarus clarkii)Dmrt1基因(PcDmrt1),分析其在雌性和雄性克氏原螯虾不同组织中及不同发育时期性腺中的表达特征,为研究克氏原螯虾性别分化与发育提供理论依据。【方法】克隆PcDmrt1基因开放阅读框(ORF),并对其进行生物信息学分析,通过实时荧光定量PCR检测PcDmrt1基因在雌性和雄性克氏原螯虾不同组织及不同发育时期性腺中的表达特征。【结果】PcDmrt1基因ORF长1752 bp,共编码583个氨基酸残基。PcDmrt1蛋白分子量64.9 kD,理论等电点(pI)为9.51,包含2个DM结构域。同源比对分析表明,克氏原螯虾PcDmrt1氨基酸序列与红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)Dmrt氨基酸序列同源性最高,为61.2%。基于Dmrt氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树表明,克氏原螯虾与东澳岩龙虾(Sagmariasus verreauxi)、红螯螯虾和美洲螯龙虾(Homarus americanus)亲缘关系较近。PcDmrt1基因在克氏原螯虾性腺、肝胰腺、鳃、脑、眼柄、肌肉和肠道7个组织中均有表达,性腺中相对表达量最高,肝胰腺和眼柄次之,在其他组织中相对表达量较低,在性腺、肝胰腺和眼柄3个组织中,雌性和雄性克氏原螯虾Pcdmrt1基因相对表达量存在显著(P<0.05)或极显著(P<0.01,下同)差异。在克氏原螯虾不同发育时期,PcDmrt1基因相对表达量在出膜后5 d出现高峰,最高表达出现在出膜后40 d,此时雄性幼虾PcDmrt1基因相对表达量极显著高于雌性幼虾。【结论】克氏原螯虾PcDmrt1蛋白含有2个DM结构域,属于典型的Dmrt家族成员,在进化上保守。PcDmrt1基因广泛表达于克氏原螯虾各组织中并在性腺中高表达,基因相对表达量在发育早期呈上升趋势,表明PcDmrt1基因可能在早期参与克氏原螯虾性别分化与组织发育。

• 膨腹海马不同生长阶段的形态特征研究

  赵春暖, 王晓梅, 于涛, 单秀娟, 任利群, 郑言鑫, 李波, 李致远, 王喜文, 陈洋,

  【目的】探究膨腹海马(Hippocampus abdominalis)不同生长阶段特殊表型性状及其相关性,筛选出影响2月龄膨腹海马体质量的主要形态性状,为辅助膨腹海马形态学研究及其人工选育打下理论基础。【方法】以人工繁育的10日龄和2月龄膨腹海马为研究对象,根据需要分别测定下颌长(X1)、上颌长(X2)、吻长(X3)、眼径(X4)、眼后头长(X5)、头长(X6)、躯干长(X7)、尾长(X8)、背鳍长(X9)、体长(X10)及体质量(Y)等表型性状,运用相关分析、主成分分析比较10日龄和2月龄膨腹海马各表型性状间的相关性及主要发育方向,并以通径分析和灰色关联度分析探究2月龄膨腹海马主要形态性状对体质量的影响。【结果】除了10日龄膨腹海马的下颌长与背鳍长间的相关性不显著(P>0.05)外,2个时期其他性状间的相关系数均达显著(P<0.05)或极显著(P<0.01,下同)水平。不同生长阶段膨腹海马主成分聚焦的方向不同,10日龄到2月龄,膨腹海马初始体长增长较快,头吻部生长发育明显,后期则聚焦于躯干部的生长。通径分析结果显示,影响2月龄膨腹海马体质量的主要形态性状是头长和体长,其中体长对体质量的直接影响最大(0.763),而头长主要通过体长间接影响体质量(0.278);构建的回归方程(Y=-1.817+0.038X6+0.029X10)可准确预测体质量的变化(F=127.556,P<0.01)。灰色关联度分析结果显示,与2月龄膨腹海马体质量关联度较高的形态性状包括躯干长、尾长、头长和体长,对应的关联系数分别为0.787、0.754、0.745和0.724。不同分析方法得出的结果略有差异,但与体质量关联度较高的形态性状中均含有体长。【结论】10日龄到2月龄膨腹海马的生长从头吻部转移到躯干生长。在以体质量为目标性状选育2月龄膨腹海马时,应以体长为主要选择性状,并兼顾头长、躯干长和尾长的协同选择。

• 瘤背石磺腹部皮肤的超微结构及其黏液抗菌特性分析

  孙梦颖, 沈和定,

  【目的】对瘤背石磺(Onchidium reevesii)腹部皮肤进行超微结构观察和皮肤黏液抗菌特性分析,为瘤背石磺皮肤免疫功能的研究和天然抗菌药物的开发提供参考依据。【方法】采集瘤背石磺腹部皮肤和皮肤黏液,采用光学显微镜和透射电镜观察瘤背石磺腹部(足部和足侧)皮肤结构、腺体和腺细胞特征,采用组织化学染色技术检测黏液细胞中的糖缀合物,用瘤背石磺皮肤黏液对7种致病菌进行处理,采用生长曲线法和抑菌圈法测定黏液的抑菌效果,并深入研究黏液对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的抑菌机理。【结果】瘤背石磺腹部皮肤黏液细胞中含有较多酸性黏多糖;足部皮肤中的黏液腺呈圆形,含有混合型黏多糖的黏液储存在中央腺腔中,足侧皮肤中的颗粒腺也分泌酸性黏多糖。根据分泌囊泡形态和致密程度的不同,足部皮肤中的腺细胞可分为6种类型,足侧皮肤中的腺细胞可分为3种类型,分泌囊泡与细胞膜融合后以胞吐的方式向外分泌。瘤背石磺皮肤黏液对7种致病菌的生长曲线均表现出抑制作用,具有广谱抗菌活性,且抑菌圈直径测定结果显示,黏液对金黄色葡萄球菌和哈维氏弧菌的抑制效果最好。扫描电镜观察结果显示,经皮肤黏液处理后,金黄色葡萄球菌和哈维氏弧菌细胞表面出现畸形和裂纹,胞质内容物流出,同时OD260变化反映黏液可增加细菌细胞膜的通透性,表明黏液可有效破坏细菌细胞膜的完整性。此外,与不经皮肤黏液处理相比,经黏液处理后,金黄色葡萄球菌和哈维氏弧菌三羧酸循环关键酶活性和ATP含量均显著降低(P<0.05,下同),Na+/K+-ATPase活性显著升高,说明黏液能破坏细菌的能量代谢过程,导致细菌生长繁殖受阻。【结论】瘤背石磺腹部皮肤具有多种类型的腺体和腺细胞,其分泌的黏液可破坏细菌的细胞膜完整性及能量代谢过程,具有广谱抑菌活性。

• 猪丁型冠状病毒NSP14蛋白截短表达及其间接ELISA抗体检测方法的建立

  刘思雨, 何颖, 卢冰霞, 赵武, 赵硕, 许心婷, 全琛宇, 秦毅斌, 欧阳康,

  【目的】进行猪丁型冠状病毒(PDCoV)NSP14蛋白截短原核表达,制备PDCoV NSP14蛋白的多克隆抗体,并建立检测PDCoV抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),为探究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断提供参考依据。【方法】以PDCoV 1468B毒株为模板,构建NSP14截短基因原核重组质粒pET32a-NSP14,经双酶切和测序鉴定后,通过原核表达系统获得NSP14融合蛋白,将其纯化后免疫新西兰大白兔获得NSP14蛋白的多克隆抗体,进行Western blotting验证,并用间接ELISA测定其效价。以NSP14融合蛋白为抗原包被酶标板,采用方阵滴定法优化一系列反应条件,构建检测PDCoV抗体的间接ELISA。【结果】在构建的pET32a-NSP14重组质粒中,NSP14蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达,其大小约40.2 kD;制备的NSP14蛋白多克隆抗体效价在1∶512000以上,经Western blotting验证,能与纯化的NSP14融合蛋白发生特异性反应。经过筛选,确定所构建检测PDCoV抗体间接ELISA的最佳反应条件:NSP14融合蛋白最佳包被浓度为4.0μg/mL,包被条件为37℃、2.0 h;封闭条件为5%脱脂奶粉封闭1.0 h;待检血清按1∶400稀释,孵育2.0 h;酶标二抗1∶2500稀释,孵育60.0 min;TMB底物显色时间为30.0 min。特异性试验结果表明,猪病阳性血清PRRSV、JEV、PCV2、PPV、PEDV和CSFV的OD450均小于0.235,说明优化的间接ELISA检测的病原与其他猪病毒阳性血清无反应,特异性良好。重复性试验结果表明,优化的间接ELISA检测猪病阳性血清的批内和批间变异系数均小于10.000%,说明优化的ELISA具有较好的重复性。【结论】成功制备具有高效价和良好免疫反应性的PDCoV NSP14蛋白多克隆抗体,并建立检测该抗体的特异性、敏感性和重复性良好的间接ELISA,可供进一步研究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断参考应用。