南方农业学报杂志

南方农业学报杂志2020年第11期

• 牛妊娠相关糖蛋白6基因密码子优化及其在HEK293细胞中的表达

  刘长彬, 卢春霞, 石国庆, 倪建宏, 卢守亮,

  目的解决天然牛妊娠相关糖蛋白(bPAG)不易分离纯化的问题,获得高效异源表达且具有良好免疫反应性的bPAG6,为国产bPAG检测产品的研发提供技术支持.方法根据宿主细胞对密码子的偏好性,利用MaxCodonTM在不改变氨基酸序列的前提下,对bPAG6基因密码子进行优化,采用全基因合成技术扩增优化后的bPAG6基因,构建proEM-bPAG6重组载体,并转染至HEK293细胞中进行高效表达;然后通过SDS-PAGE电泳、Western blotting和ELISA检测重组蛋白的表达效果及免疫反应性,并利用在线生物信息学分析软件对重组蛋白的结构及功能进行预测.结果优化后bPAG6基因的密码子适用指数(CAI)由0.80提高到0.96,G+C含量由49.4%提高到58.8%,其蛋白编码区(CDS)长度为1137 bp,共编码379个氨基酸残基.将全基因合成技术扩增获得的bPAG6基因插入proEM载体构建proEM-bPAG6重组载体,经EcoR I和Hind III双酶切鉴定可获得2条与预期结果相符的片段proEM载体(4369 bp)和bPAG6基因(1176 bp),测序结果也显示其碱基序列与优化后的bPAG6基因完全一致.proEM-bPAG6重组载体转染HEK293细胞表达获得的重组蛋白bPAG6分子量约46 kD.重组蛋白bPAG6可被抗bPAG6抗体识别,即具有良好的免疫反应性.重组蛋白bPAG6信号肽由N端的前15个氨基酸残基组成;存在5个N-糖基化位点,其N-糖基化修饰主要位于57Asn、73Asn、102Asn、124Asn和181Asn位点处;重组蛋白bPAG6为分泌性蛋白,无跨膜螺旋区,其二级结构由无规则卷曲(42.74%)、延伸链(31.93%)、α-螺旋(19.26%)和β-转角(6.07%)组成.结论通过基因优化及真核表达获得的重组蛋白bPAG6具有良好免疫反应性,可作为抗原应用于牛早期妊娠快速诊断产品的研发.

• 水稻锌指蛋白基因CRISPR/Cas9突变体的构建及突变分析

  易勇, 郑瑞, 杨波, 栾维江, 郭嗣斌, 沙爱华,

  目的通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对水稻锌指蛋白基因(OsC3H54)进行基因编辑,筛选鉴定出其突变体植株,为深入研究OsC3H54的生物学功能提供良好材料,也为水稻锌指蛋白研究提供参考依据.方法通过E-CRISP在OsC3H54基因的外显子上设计靶点序列,将靶点序列连接至OsU6SK载体上,再与Cas9一起连接到pCAM-BIA1300双元载体上,获得CRISPR/Cas9重组双元载体,通过农杆菌介导将其转入日本晴水稻愈伤组织,利用潮霉素进行抗性筛选,获得突变体植株,并分析其靶点位置的碱基及编码氨基酸突变情况.结果在OsC3H54基因第2个外显子上找到2个符合靶点设计要求的靶点,分别为TG1:5'-CCGCCGCGGCTGCCTTTGGATAC-3'和TG2:5'-CCTTCCC CAATGGCGGGGGTGGC-3'.将OsU6SK载体和靶点序列正确连接的重组载体与Cas9一起连接至pCAMBIA1300双载体上,成功获得CRISPR/Cas9重组双元载体(pCAMBIA1300-Cas9-TG1和pCAMBIA1300-Cas9-TG2).通过农杆菌介导转入日本晴水稻,经潮霉素抗性筛选获得TG1靶点株系和TG2靶点株系,共16株CRISPR/Cas9突变体植株.CRISPR/Cas9突变体植株在靶点序列的突变位点位置附近出现套峰,表明2个株系的植株均发生碱基突变,其中Y1、Y2、Y3和Y4突变体植株均为单碱基插入突变,最终导致编码的氨基酸发生移码突变,蛋白翻译提前终止.结论水稻OsC3H54基因CRISPR/Cas9突变体植株的获得为进一步研究水稻锌指蛋白生物学功能提供了良好材料.

• 海岛棉H268 PPR蛋白家族基因鉴定及SNP/InDel分析

  李枝玲, 孔祥军, 郑杰, 韦美玲, 李斌, 周瑞阳,

  目的通过对海岛棉不育系H276A及其育性恢复材料H268进行三角状五肽重复蛋白(PPR)家族基因鉴定及比对分析,获得序列存在差异的PPR基因,为后续育性恢复基因(Rf)的发掘提供理论基础.方法通过生物信息学分析海岛棉PPR基因,并对其进行亚细胞定位预测与功能注释分析;采用Illumina HiSeq 4000高通量测序技术对海岛棉H276A及H268对PPR蛋白家族基因进行转录组测序,将筛选获得的PPR蛋白与其他植物具有育性恢复的PPR蛋白进行氨基酸序列同源比对并构建系统发育进化树.结果鉴定获得912个PPR基因,其中有846个在海岛棉H276A和H268间存在序列差异,且分别存在7226个SNP差异位点和301个InDel差异位点,其中作用于线粒体的PPR基因有2143个SNP差异位点和134个InDel差异位点.转录组测序结果显示,共检测到表达基因数量为68197个,其中已知基因56311个、新基因11886个,可满足后续数据分析.GO功能注释结果显示,PPR基因主要富集于生物学过程,富集于分子功能的PPR基因最少.50.0%PPR蛋白定位于线粒体,29.0%PPR蛋白定位于叶绿体,0.9%PPR蛋白定位于细胞核,20.0%PPR蛋白定位于胞外,0.1%PPR蛋白定位于细胞质膜.xp_016708712(LOC107923023)和xp_016710013(LOC107924193)与多个具有育性恢复功能的PPR蛋白氨基酸序列相似性达33%,说明二者亲缘关系较近,且亚细胞定位于线粒体.结论xp_016708712和xp_0167100132个PPR蛋白可能与海岛棉不育系H276A育性恢复相关,可用于发掘海岛棉CMS的Rf基因.

• 南美蟛蜞菊WtActin1基因克隆及表达稳定性分析

  李红春, 肖雨沙, 王小兰, 宋莉英,

  目的克隆南美蟛蜞菊肌动蛋白基因(WtActin1),并进行生物信息学及表达稳定性分析,为南美蟛蜞菊耐热耐冷功能基因表达及调控研究提供可靠的内参基因.方法RACE克隆WtActin1基因,通过在线生物信息学分析软件对其氨基酸序列进行分析,并利用实时荧光定量PCR检测该基因在不同组织及温度胁迫下的表达情况.结果克隆获得的WtActin1基因cDNA全长1682 bp(GenBank登录号MN485900),其中5'非编码区(5'-UTR)170 bp,3'非编码区(3'-UTR)378 bp,开放阅读框(ORF)1134 bp,编码377个氨基酸残基.WtActin1蛋白分子量为41725.81 Da,理论等电点(pI)为5.31,不稳定性指数(II)为37.48,亲水性的平均值(GRAVY)为-0.166,为稳定的亲水性蛋白,无跨膜结构域和无信号肽,主要存在于细胞质中,具有Actin蛋白家族的典型特征结构,其二级结构主要由α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲组成,三级结构同源模型为嵌合肌动(3ci5.1.A),与莴苣、橡胶草和洋蓟的同源蛋白三级结构高度相似.WtActin1基因与其他植物Actin基因核苷酸序列相似性在86.4%以上,其推导氨基酸序列相似性在94.0%以上.从基于Actin氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树可看出,WtActin1与同为菊科的莴苣LsActin7亲缘关系最近,与传统分类学相吻合,其次是菊科的橡胶草TkActin1和锦葵科的棉花GhActin.WtActin1基因在南美蟛蜞菊根、茎、叶和花中的表达量均无显著差异(P>0.05,下同),且在高、低温胁迫下与正常温度处理的表达量也均无显著差异.结论WtAtin1基因属于Actin基因家族成员,在不同组织及温度胁迫下均能稳定表达,可作为内参基因用于南美蟛蜞菊耐热耐冷功能基因研究.

• 东方山羊豆种质资源ISSR分析

  罗天琼, 王小利, 张瑜, 莫本田, 张明均,

  目的分析东方山羊豆种质资源遗传多样性,为其种质资源鉴定评价、新品种选育及开发利用提供理论参考.方法以4份引进东方山羊豆种质及其29份杂交后代为材料,利用ISSR引物对其进行多态性扩增,并以PopGene 32计算其遗传参数,采用NTsys-pc 2.1计算遗传相似系数,运用SHAN模型中的非加权配对算术平均法(UPGMA)绘制聚类树状图.结果从24条ISSR引物中筛选出8条扩增条带清晰、多态性良好且易扩增的引物,利用其从33份东方山羊豆种质材料中共扩增出79条条带,其中65条具有多态性,多态百分率为82.15%;观察等位基因数(Na)为1.6667~2.0000,平均为1.8215,有效等位基因数(Ne)为1.2212~1.5740,平均为1.4242;Nei'基因多样性指数(H)为0.1521~0.3322,平均为0.2509,Shannon多态信息指数(I)为0.2473~0.4976,平均为0.3813.这些种质材料遗传相似系数为0.5696~0.9241,平均为0.7623,在0.7140处可划分为三大类群(Ⅰ~Ⅲ),分别包含25、3和5份种质材料,不同地理来源种质相互混杂分布.结论东方山羊豆遗传多样性较丰富,其中第Ⅱ类群和第Ⅲ类群遗传多样性较第Ⅰ类群更丰富,具有优良亲本基因源选择的潜力,可作为东方山羊豆不同亲本选配和杂种优势加以利用.

• 基于灰色关联度分析法综合评价24个绿豆新品种(系)在桂南地区的田间性状表现

  陈燕华, 李经成, 李荣丹, 唐建淮, 罗高玲,

  目的采用灰色关联度分析法综合评价24个绿豆新品种(系)在桂南地区的田间性状表现,分析产量与其他性状的关联度,筛选出综合表现优异的绿豆品种(系),为桂南地区及与其生态环境相似地区的绿豆育种和生产提供优良品种.方法以2016─2017年参加国家食用豆产业技术体系多点联合鉴定试验的24个绿豆新品种(系)及对照品种中绿5号(CK)为材料,测定14个性状(10个主要农艺性状和4个抗逆性状)的田间表现,确定参考品种的性状表现,采用灰色关联度分析法分析小区产量与其他13个性状的关联度以及参试绿豆品种(系)与参考品种的加权关联度.结果小区产量与其他13个性状的关联度顺序为单株粒重(0.8685)>百粒重(0.7997)>荚长(0.7852)>单株荚数(0.7821)>抗青枯病率(0.7634)>单荚粒数(0.7488)>主茎节数(0.7314)>抗倒伏率(0.7194)>主茎分枝(0.7074)>抗晕疫病率(0.6959)>抗叶斑病率(0.6924)>株高(0.6580)>生育天数(0.6278),说明单株粒重对小区产量的影响最大,其次为百粒重和荚长,以生育天数影响最小.基于等权关联度、加权关联度和小区产量对25个绿豆品种(系)进行排名,结果显示,鄂绿5号和冀绿0816排名均分别位于第1名和第2名,综合表现较其他参试品种好;保绿201012-7、中绿5号(CK)、渝黑绿3号、142-139与保绿200810-15个品种的等权关联度、加权关联度和产量排名均位于前7名,综合表现也较好.结论桂南地区在选育高产绿豆新品种时应选择单株粒重和百粒重较重、粒大、荚长、荚多的亲本材料,同时要兼顾青枯病抗性和单荚粒数等性状.鄂绿5号、冀绿0816、保绿201012-7、渝黑绿3号、142-139和保绿200810-1等6个绿豆新品种(系)适宜在桂南地区及与其生态环境相似地区大面积推广种植.

• 绿肥粉垄耦合对稻田耕层土壤团粒结构特征的影响

  郑佳舜, 胡钧铭, 韦燕燕, 李婷婷, 苏世鸣, 韦翔华, 何铁光, 夏旭,

  目的研究稻田生态系统耕层优化对双季稻田耕层土壤团粒结构特征的影响,为探明和评估绿肥粉垄耦合土壤物理结构特征及稻田土壤逆境调控提供理论依据.方法2017—2018年在广西农业科学院试验田(南宁)开展为期4个稻季的定位试验,早稻采用粉垄耕作(F)和常规耕作(C)2种方式,以不施肥(N)为对照,设置常规施用化肥(N0)、同等肥力条件下单倍绿肥配施化肥(N1)和双倍绿肥配施化肥(N2),共设8个处理(CN、CN0、CN1、CN2、FN、FN0、FN1、FN2),晚稻实行常规施用化肥免耕.采用粒度分析仪测定0~15、15~30和30~45 cm耕层黏粒、粉粒、砂粒的土壤粒径含量;采用湿筛法测定0~15 cm层土壤水稳性团聚体含量,计算土壤水稳性团聚体凝聚力的关键指标,即平均重量直径(MWD)和几何平均直径(GMD);采用电子显微镜扫描团聚体超微观形态结构;采用土壤紧实度仪测定不同耕层土壤紧实度.结果FN1处理提高了0~15和30~45 cm土壤黏粒含量,其中早稻分别增加0.75%和2.10%,晚稻分别增加0.67%和0.09%;FN2提高了除晚稻30~45 cm以外的其他耕层土壤粉粒含量.绿肥粉垄耦合能提高稻田土壤团聚体的凝聚效果.同一季稻田粉垄耕作土壤MWD和GWD均低于常规耕作,其中早稻和晚稻粉垄耕作土壤MWD较常规耕作分别降低0.19~0.96和0.47~0.72 mm,GMD较常规耕作分别降低0.36~1.52和0.79~1.15 mm.绿肥用量的增加有效提高了土壤MWD和GMD,其中FN1和FN2早稻处理下分别提高0.75和1.06 mm,晚稻分别提高0.21和0.31 mm.FN1处理提高土壤持水性和通气性,有效促进了土壤团聚体的形成.粉垄耕作下土壤微观结构呈孔隙多而偏小,空洞少而偏大的特征.晚稻FN1处理的土壤微团聚体和大团聚体含量最高,分别占8.60%和29.09%,免耕晚稻的土壤微团聚体和大团聚体含量较粉垄早稻有所提升,FN1处理增加了3.88%和1.34%,FN2处理增加了12.04%和9.01%.粉垄耕作下早、晚稻不同土层土壤紧实度均低于常规耕作,免耕晚稻的土壤紧实度高于免耕早稻.与常规耕作相比,FN1早稻土壤紧实度从土层自上而下分别降低8.90、22.73和55.15 kPa,晚稻分别降低1.20、28.84和53.93 kPa,FN2早稻分别降低5.80、25.37和66.00 kPa,晚稻分别降低6.80、36.97和50.33 kPa.结论绿肥还田对粉垄耕作稻田土壤微形态结构特征产生重要影响,绿肥粉垄耦合有助于集约化水稻抗逆栽培、实现减肥增效.

• 岩溶区种植砂糖桔对石灰土有机氮矿化过程的影响

  杨会, 朱同彬, 吴夏, 郝玉培, 吴华英,

  目的土壤有机氮矿化是产生无机氮的主要过程,研究岩溶区不同土地利用方式对有机氮矿化过程的影响,为岩溶区农业种植提供理论依据.方法选择岩溶区由灰岩和泥晶灰岩发育而来的石灰土作为研究对象,测定土壤的理化性质和碳化学结构,并采用15N同位素标记方法,研究由乔灌地开垦种植砂糖桔后土壤有机质的数量和质量对有机氮矿化速率的影响.结果乔灌地开垦种植砂糖桔后,两种石灰土的土壤有机碳(SOC)、全氮(TN)、钙(Ca)含量、土壤田间持水量(WHC)和pH均显著降低(P0.05,下同).灰岩发育的石灰土碳化学结构变化不显著,泥晶灰岩发育的石灰土烷基碳从21.9%显著增至25.7%,羰基碳从16.0%显著降至13.5%.由灰岩和泥晶灰岩发育成的石灰土有机氮总矿化速率(MNorg)分别由2.96和2.22 mg N/(kg·d)降至0.66和1.05 mg N/(kg·d),主要归于易利用有机氮矿化速率(MNlab)的降低.灰岩发育的石灰土难利用有机氮矿化速率(MNrec)变化不明显,泥晶灰岩发育的石灰土MNrec由0.36 mg N/(kg·d)提高至0.66 mg N/(kg·d).泥晶灰岩发育的石灰土MNorg和MNlab主要受控于土壤有机质数量,与SOC和TN含量呈显著正相关;MNrec受有机质结构组成的影响,与烷基碳呈显著正相关.灰岩发育的石灰土MNorg和MNlab除受有机质数量影响外,还受土壤岩性的影响,与Ca含量呈极显著正相关(P<0.01,下同),与Fe、Al含量和粘粒比例呈极显著负相关.结论乔灌地开垦种植砂糖桔导致不同灰岩发育的石灰土有机氮总矿化速率均显著降低,土壤无机氮供应能力减弱.

• 粉垄耕作对甘蔗根系生长及氮素吸收利用的调控作用

  王奇, 朱艳春, 申章佑, 周佳, 尹昌喜, 韦本辉,

  目的探究粉垄耕作对甘蔗根系生长和氮素吸收利用的调控作用,为粉垄耕作技术在甘蔗生产中的推广应用提供理论依据.方法以甘蔗品种福农41为试验材料,以传统耕作为对照,研究粉垄耕作对甘蔗根系生物量和氮含量的影响;采用转录组测序(RNA-seq)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析粉垄耕作对甘蔗根系中氮素吸收利用相关基因表达水平的调控作用.结果与传统耕作相比,粉垄耕作条件下甘蔗根系鲜重、干重、氮含量分别显著增加48.7%、46.8%和50.0%(P<0.05).RNA-seq分析结果表明,2种耕作方式的甘蔗根系存在14020个差异表达基因,其中12565个基因在粉垄耕作甘蔗根系中上调表达、1455个基因在粉垄耕作甘蔗根系中下调表达.进一步筛选到45个氮吸收利用相关的差异表达基因,包括硝酸盐转运蛋白基因、硝酸还原酶基因、亚硝酸还原酶基因、谷氨酰胺合成酶基因、谷氨酸合酶基因等,其中有44个氮吸收利用相关基因在粉垄耕作根系中上调表达.qRT-PCR分析结果显示,3个有代表性的差异表达基因TRINITY_DN194141_c0_g1、TRINITY_DN252586_c0_g1和TRINITY_DN241177_c0_g1在2种耕作方式甘蔗根系中的表达差异趋势与RNA-seq分析结果一致.结论粉垄耕作可能通过上调甘蔗根系中氮素吸收利用相关基因表达水平来增加甘蔗根系对氮的吸收利用能力,而增加甘蔗根系中氮含量并促进根系生长;此外,由于粉垄耕作的甘蔗根系更发达,可能通过增加根系与土壤接触的总面积,进而促进甘蔗根系对土壤中氮素的吸收利用.

• 低分子有机酸对贵州黄壤龙葵吸收镉的影响

  刘桂华, 秦松, 柴冠群, 吴正卓, 范成五,

  目的探讨低分子有机酸对龙葵吸收镉(Cd)的影响,以期为提高贵州地区黄壤重金属污染的植物修复效率提供科学依据.方法采用盆栽试验种植龙葵,待龙葵生长60 d后,将不同浓度的低分子有机酸(柠檬酸、苹果酸和酒石酸)及其复合处理(柠檬酸+苹果酸、柠檬酸+酒石酸)以溶液形式加入土壤,以添加500 mL去离子水为对照(CK),1个月后收获植株样品并采集土壤样品,分析不同处理对龙葵生长及吸收转运重金属Cd的影响.结果柠檬酸添加量为2.5 mmol/kg时龙葵单株生物量最高,较CK显著增加6.75%(P酒石酸>柠檬酸,各部位的Cd含量表现为叶>茎>根>果实,且均在苹果酸添加量为5.0 mmol/kg时达最大值,分别为CK的1.68、1.53、1.21和1.32倍.添加2.5 mmol/kg酒石酸和5.0 mmol/kg苹果酸时龙葵对Cd的累积量较高,二者显著高于其他处理.添加柠檬酸、苹果酸和酒石酸均能提高龙葵对Cd的转移和富集能力,作用表现为苹果酸>酒石酸>柠檬酸,其中,添加5.0 mmol/kg苹果酸时龙葵对Cd的富集系数最大,为12.81.相对于单一有机酸处理,复合有机酸处理对龙葵富集Cd的能力无明显优势.结论添加适当浓度的柠檬酸、苹果酸和酒石酸均能提高龙葵各部位对Cd的吸收及土壤Cd从地下向地上部转移的能力,促进龙葵对Cd的转移和富集;其中苹果酸添加量为5.0 mmol/kg时,龙葵对Cd的累积量相对较高且富集系数最大,对土壤中Cd的植物修复效果最好.

• 绿肥、蚕沙有机肥配施化肥对免耕稻田土壤碳库平衡的影响

  刘顺翱, 吴昊, 胡钧铭, 韦翔华, 刘开强, 蒙炎成, 李婷婷, 魏宗辉,

  目的探索免耕稻田绿肥、蚕沙有机肥投入对土壤有机碳积累及CO2和CH4排放的影响,为保护性耕作稻田土壤碳固持及稻田减肥增效的农业有机资源可持续利用提供理论依据.方法在前期粉垄与常规耕作基础上,2018—2019年连续开展田间免耕试验,在同等养分投入条件下,设置绿肥、蚕沙有机肥与化肥配施模式,以常规施用化肥为对照,同步设不施肥空白对照,保护性耕作试验第2年,采用分离式静态箱—气象色谱法测定稻田温室气体CO2和CH4排放通量,同时在水稻返青期、分蘖期、齐穗期和收获期采集0~15 cm耕层土壤,测定土壤有机碳含量.结果在粉垄免耕模式下,蚕沙有机肥配施化肥处理耕层土壤有机碳含量在返青期和分蘖期较常规免耕模式提高56%和19%;水稻返青期、分蘖期、齐穗期和收获期粉垄免耕稻田绿肥配施化肥处理的土壤有机碳含量较单施化肥处理分别提高111%、30%、74%和31%,较不施肥处理分别提高90%、22%、58%和22%;蚕沙有机肥配施化肥处理较单施化肥处理分别提高148%、90%、48%和39%,较不施肥处理分别提高113%、78%、35%和29%.粉垄免耕模式下,与单施化肥处理相比,绿肥配施化肥处理的CO2累积排放量降低16.9%,蚕沙有机肥配施化肥处理降低15.1%;CH4排放通量出现2个峰值,常规免耕和粉垄免耕模式下,绿肥配施化肥处理的CH4排放通量峰值分别是单施化肥处理的7.69和7.61倍.绿肥和蚕沙有机肥配施化肥降低了稻田土壤CO2累积排放量,增加了CH4累积排放量.结论粉垄免耕稻田施用绿肥、蚕沙有机肥利于土壤有机碳积累,减少CO2温室气体排放,可作为一种稻田土壤固碳减排可持续生产应用技术.

• 我国朱槿曲叶病毒病及其传播介体烟粉虱分布调查

  陈婷, 汤亚飞, 何自福, 吕利华, 齐国君,

  目的明确我国朱槿植株上木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus,CLCuMuV)引起的朱槿曲叶病发生情况及烟粉虱隐种种群组成,为朱槿曲叶病的早期监测及基于控制传播介体的病毒防控提供科学依据.方法2017年11月—2018年8月,从我国广东、广西、海南、云南、福建、新疆、内蒙、山东、浙江和四川等10省(区)32市(县)的城市绿化区域(公园、公路旁绿化区域)及花卉市场采集朱槿曲叶病疑似病株及健康朱槿植株叶片,运用PCR进行CLCuMuV检测,并利用mtCOⅠ基因序列对采自田间朱槿植株上的单头烟粉虱进行隐种鉴定及UPGMA聚类分析.结果我国广东、广西、海南、云南和福建5省(区)绿化朱槿被CLCuMuV侵染发病的比率较高,平均为44.43%~81.95%,高于新疆(4.39%)和内蒙古(0.63%)的发病率,而山东、浙江和四川的朱槿植株暂未发现CLCuMuV感染.在大部分采样点,烟粉虱种群密度较低,除内蒙古的平均虫株率为15.00%外,其他省(区)的平均虫株率均低于5.00%.对采集的烟粉虱隐种鉴定结果表明,烟粉虱种群包括MEAM1、MED、AsiaⅡ7、AsiaⅡ1和AsiaⅠ等5个隐种,其中AsiaⅡ7和MEAM1为优势种群,所占比例分别为44.7%和32.5%.结论目前我国南方地区朱槿曲叶病发病率较高,其传毒介体烟粉虱AsiaⅡ7和MEAM1为优势种群.随着朱槿盆栽花卉贸易及苗木跨区调运,CLCuMuV有向内地逐渐扩散的趋势,应采取相应措施提早防范木尔坦棉花曲叶病毒在我国棉区发生流行.

• 聚乙二醇介导咖啡炭疽菌遗传转化体系的建立

  陆英, 贺春萍, 吴伟怀, 梁艳琼, 黄兴, 郑金龙, 李锐, 易克贤,

  目的建立高效制备咖啡炭疽菌原生质体及聚乙二醇(PEG)介导的遗传转化体系的方法,为开展咖啡炭疽菌的致病分子机理研究打下基础.方法以咖啡炭疽菌野生型菌株BSC2-2为试验材料,通过PEG介导原生质体转化法将含有氯嘧磺隆标记和绿色荧光蛋白报告基因(GFP)的质粒pCB1532-G转入BSC2-2原生质体中,对获得的转化子进行遗传稳定检测、PCR分子检测和激光共聚焦显微观察.结果BSC2-2对氯嘧磺隆的耐受浓度为200.0 mg/L.最佳遗传转化体系为:28℃下用2.5%裂解酶酶解BSC2-2菌丝2 h,收集原生质体,再经MTC缓冲液冲洗重悬后将质粒pCB1532-G转入原生质体,在RM培养基中混匀再生,获得转化子.GFP基因的PCR扩增和分生孢子荧光观察结果表明,GFP基因已成功插入并整合到咖啡炭疽菌BSC2-2基因组中.转化子与野生型菌株在菌落形态、生长速率及致病力上无明显差别,表明GFP基因在咖啡炭疽菌BSC2-2基因组中稳定遗传.结论成功建立了PEG介导的咖啡炭疽菌遗传转化体系,获得与野生型菌株在菌落形态、生长速率及致病性上无明显差别的转化子,为后续研究咖啡炭疽菌的基因功能和致病机理提供技术支持.

• 2株木霉抑菌效果及其促植物生长机制

  张晓梦, 田永强, 潘晓梅, 李佳佳, 石晓玲, 张建强, 吴康莉,

  目的探究绿色木霉(Trichoderma viride)和棘孢木霉(T.asperellum)对8种植物病原菌的抑制效果及其促植物生长机制,为木霉防治植物病害和促进植物生长等的田间应用提供理论参考.方法采用平板对峙法和固体稀释法,检测2株木霉及其活性代谢产物对8种植物病原菌(棉花枯萎病菌、茄子菌核病菌、番茄链格孢病菌、茄腐镰刀病菌、尖孢镰刀病菌、枸杞炭疽病菌、番茄灰霉病菌和番茄匍柄霉病菌)的抑制率;采用平板透明圈法、Salkowski比色法及钼锑抗比色法测定2株木霉的生防因子、生长素及溶磷效果;通过辣椒盆栽试验,测定2株木霉发酵液不同稀释倍数处理对辣椒叶片叶绿素含量及3种抗性酶过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影响.结果平板对峙试验结果显示,2株木霉对8种植物病原菌的抑菌率均在60.00%以上;绿色木霉发酵11 d时其无菌滤液对茄子菌核病菌的抑制率达96.78%,但对其他病原菌的抑制率不高;棘孢木霉发酵11 d时无菌滤液对茄子菌核病菌、枸杞炭疽病菌和番茄链格孢病菌的抑制效果较好,抑菌率分别为99.08%、85.33%和68.65%,发酵9 d时无菌滤液对番茄灰霉病菌的抑制率为72.08%;2株木霉均可产生蛋白酶、几丁质酶、纤维素酶和铁载体4种生防因子;绿色木霉发酵9 d时分泌吲哚乙酸(IAA)量为3.389 mg/L,在PKO无机磷液体培养基培养7 d后溶磷量为67.236μg/mL;棘孢木霉发酵11 d时分泌IAA量达11.638 mg/L,在PKO无机磷液体培养基培养7 d后溶磷量达151.905μg/mL;盆栽试验结果表明,喷施不同稀释倍数的棘孢木霉发酵液较绿色木霉发酵液更能提高辣椒叶片叶绿素含量及3种抗性酶活性.结论供试2株木霉对8种植物病原菌均具有抑制能力并存在多种生防因子和促植物生长能力,其中棘孢木霉较绿色木霉具有更好的抑菌和促进植物生长及提高植物叶片叶绿素含量和抗性酶活性的能力,具有较好的田间应用潜力.

• 烟草田间蛴螬种类及其空间分布与抽样技术研究

  刘思雨, 户艳霞, 范志勇, 杜广祖, 孙军伟, 陈斌,

  目的明确烟草田间蛴螬类害虫的种类组成及种群空间分布特点,为蛴螬类害虫的预测预报及田间防控提供理论指导.方法于2015—2019年,以云南省大理州弥渡县红花大金元烟田为调查点,采用五点取样法对烟田中的蛴螬种类组成进行系统调查;利用Iwao回归法和Taylor幂函数法计算测定蛴螬混合种群的空间分布特征,并利用种群聚集均数分析蛴螬类害虫在田间的聚集原因;根据空间分布格局,模拟形成烟田蛴螬混合种群的抽样技术.结果云南省大理州弥渡县红花大金元烟田共发现5种蛴螬,隶属于3科5属,其中小黄鳃金龟(Metabolus flavescens Brenske)和铜绿丽金龟(Anomala corpulenta Motschulsky)是优势种,相对多度分别为33.09%和34.96%.蛴螬混合种群在红花大金元烟田中主要以个体群呈聚集分布,且聚集程度与密度呈正相关,但个体间相互排斥.聚集均数(λ)分析结果显示λ值均小于2,表明蛴螬在田间的聚集原因主要是由气候、土壤湿度和植株生长状况等环境因素引起.根据Iwao的m*-m回归方程,建立了不同精度下蛴螬类害虫的理论抽样数和序贯抽样模型,当蛴螬防治标准为2头/株时,蛴螬田间的累积虫量高于上限指标(T1)即应采取防治措施.结论云南省大理州弥渡县烟区红花大金元烟田共有5种蛴螬混合发生,混合种群主要以个体群在田间呈聚集分布,聚集度依赖于密度,聚集原因主要由环境因素引起.

• 松材线虫效应蛋白Bx-FAR-1的原核表达与活性测定

  李煜, 吴小芹, 胡龙娇,

  目的纯化获得松材线虫效应蛋白Bx-FAR-1并验证其体外活性,为后续研究效应蛋白Bx-FAR-1参与松材线虫侵染松树的分子机制打下基础.方法利用PCR技术从松材线虫cDNA中扩增出效应基因Bx-FAR-1,用同源重组的方式将目的片段连接至原核表达载体pET-32a(+).通过原核表达系统诱导并纯化获得大量效应蛋白Bx-FAR-1,利用SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting对纯化获得的蛋白进行鉴定,同时通过本氏烟瞬时表达系统验证蛋白活性.结果从松材线虫cDNA中成功扩增出Bx-FAR-1基因(BXY_1685000.1);通过同源重组成功获得重组表达载体pET32a-BxFAR,并转化至大肠杆菌BL21感受态细胞.当诱导条件为15℃下150 r/min诱导16 h时重组蛋白以可溶性形式表达,且蛋白表达量高.效应蛋白Bx-FAR-1活性测定结果显示,当蛋白浓度达100 nmol/L时,可抑制致病疫霉的病原相关分子模式(PAMP)INF1引起的烟草细胞坏死.结论松材线虫效应蛋白Bx-FAR-1可抑制寄主植物的免疫反应.

• 钛离子注入种子对油茶幼苗叶绿体DNA、叶绿素含量和光合参数的影响

  李维伟, 黎傲日, 郭怡菲, 李观林, 肖文静, 曾艳玲,

  目的探讨钛离子注入对油茶生长过程中叶绿体及光合作用的影响,利用离子注入技术进行油茶种质创制及选育提供科学依据.方法以油茶品种华硕为试材,设置6×1016、9×1016、12×1016、15×1016和18×1016 Ti2+/cm25种剂量的钛离子,分别注入油茶种子,以未进行注入处理的种子作为对照,在相同条件下播种培育.采摘幼叶进行DNA提取,对叶绿体基因组的部分基因片段的序列进行扩增、纯化,并定期测量其叶绿素含量和光合参数,连续3年(2016—2018年)追踪研究其叶绿体DNA的变异、叶绿素相对含量及净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)的变化规律.结果钛离子注入处理会引起叶绿体DNA少数碱基置换,虽然注入剂量越大置换相对增多,但不存在明显的缺失或插入现象;叶绿素相对含量和光合参数均呈现马鞍形变化;钛离子注入浓度为6×1016和12×1016 Ti2+/cm2时,叶绿素含量相对较高,但随着生长年份增加,优势逐渐减小;处理后当年各试验组Pn差异不显著(P>0.05,下同),但第2和第3年,6×1016 Ti2+/cm2注入组Pn显著高于对照组(P<0.05,下同),分别增加13.94%和12.56%;第1、2年中Gs和Tr各组差异不明显,而第3年差异开始增大,在注入浓度为0及6×1016 Ti2+/cm2时Gs分别为最低组的235.78%和249.55%,而在注入浓度为6×1016 Ti2+/cm2 Tr是最低组的239.24%;在第1年中,对照组Ci为508.4074μL/L,是最低组的213.72%,第2年中对照组与其他各组均存在显著差异,达该年度最高值,为288.2563μL/L,较其他处理组增加6.66%~17.98%,但第3年对照与其他组差异减小.结论钛离子注入浓度的差异对叶绿素的影响暂时不稳定,但当钛离子注入浓度为6×1016 Ti2+/cm2时,对油茶的综合作用效果最佳,能促进油茶净光合速率的提升以及蒸腾作用的加强.

• 湖南省宽皮柑橘主产区土壤及柑橘叶片和果实营养元素状况分析

  韩健, 赵宜波, 李先信, 罗赛男, 符红艳, 马先锋, 邓子牛,

  目的对湖南省宽皮柑橘主产区部分果园土壤和柑橘树体的营养元素进行丰缺性分析,为湖南省宽皮柑橘合理施肥提供科学依据.方法采用定点采样分析方法,采集湖南泸溪、石门和永顺3个宽皮柑橘主产区207个样点的土壤、柑橘叶片和果实,测定其营养元素含量,同时分析土壤有机质、pH和养分状况,并与柑橘营养诊断标准进行比较,确定宽皮柑橘主产区各橘园的土壤、柑橘叶片和果实养分丰缺情况.结果湖南省宽皮柑橘主产区土壤状况表现为:土壤pH整体偏低,处于5.5~6.5适宜比例的样点仅占13.04%;26.09%的样点有机质含量偏低.不同地区、不同土壤类型的果园土壤、柑橘叶片和果实养分含量差异明显.土壤差异百分比最大为铁元素(95.14%),叶片差异百分比最大为铜元素(86.36%),果实差异百分比最大为锰元素(94.77%).潮土、红壤、紫色土3种类型土壤碱解氮含量无明显差异,其他元素差异明显;土壤大量元素主要问题在于氮肥的使用与吸收,缺乏氮比例高达100.00%,中量元素交换性钙、交换性镁均缺乏,微量元素有效铁、有效锰过量,而有效硼缺乏.叶片大量元素与土壤有效磷、速效钾丰缺情况不完全一致;中量元素钙、镁缺乏,与土壤中交换性钙、交换性镁缺乏较一致;微量元素与土壤各微量元素丰缺情况不完全一致.3个产区柑橘果实养分的氮、钾、钙、镁含量差异不明显,但微量元素含量差异明显.结论湖南省宽皮柑橘主产区应选择碱性有机肥改良土壤pH,注意补充氮肥和硼肥.另外,由于宽皮柑橘果实带走的钙和镁养分较多,土壤易缺乏钙、镁,应重视补充钙肥和镁肥;而土壤锰含量过高,应注意减少锰肥的用量.

• 喷灌沼液对茶园土壤性质及茶叶产量和品质的影响

  胡振民, 万青, 李欢, 李勇, 李荣林, 杨亦扬,

  目的研究茶园土壤施用沼液效果,为提高江苏茶叶产量和品质提供技术参考.方法对畜禽粪便发酵得到的沼液,按照0(对照)、51、102和153 t/ha梯度用量结合喷灌在江苏常州市露源生态茶业有限公司良种茶场中施用,分析不同沼液施用量下茶园土壤有机质、氮磷钾和重金属含量及春茶产量、品质等指标的变化情况.结果随着沼液施用量的增加,茶园土壤pH逐渐降低但仍在茶树生长适宜的pH范围(4.5~6.0)内,有效态的钾、钙、镁、锰、锌和铝等元素含量呈下降趋势,土壤有机质和全氮含量未有显著变化(P>0.05,下同).在153 t/ha沼液施用量下,春茶发芽密度、百芽重和产量均显著升高(P<0.05,下同),分别较对照提升77.78%、8.79%和93.40%;施用沼液后,茶叶全氮含量显著升高,游离氨基酸总量在153 t/ha沼液施用量下显著升高,茶叶茶多酚总量下降10.49%~14.65%,酚氨比显著下降.施用沼液对春茶中大量元素磷、钾、钙、镁和微量元素含量未有显著影响(除锰含量显著下降外).同时,沼液施用后土壤和春茶中的镉、铬、铜、铅等重金属含量均在安全范围内.结论在茶园中施用沼液,能提升春茶产量和品质,同时保证土壤和茶叶重金属含量安全;但由于单独施用沼液会造成土壤中钾亏损,因此在实际生产中建议通过沼液和钾肥配施以补充钾元素.

• 叶面喷施外源ABA对胡椒抗寒生理生化及ABA信号转导相关基因的影响

  伍宝朵, 崔鑫, 胡丽松, 范睿, 朱春梅, 杨建峰, 郝朝运,

  目的筛选出能提高胡椒抗寒性的脱落酸(ABA)适宜浓度,明确低温胁迫条件下外施适宜浓度ABA对胡椒叶片ABA信号转导相关基因SnRK2和PYL表达的影响,为生产上提高胡椒抗寒技术及揭示ABA信号在胡椒抗寒中的作用机理提供依据.方法以热引1号胡椒为试验材料,通过叶面喷施0(CK)、25(T1)、50(T2)、75(T3)、100(T4)mg/L ABA及4℃低温胁迫处理,测定各处理胡椒叶片叶绿素荧光参数、抗氧化酶活性(POD、CAT和SOD)、H2O2和MDA含量.在筛选出适宜ABA喷施浓度的基础上,进一步运用实时荧光定量PCR分析ABA信号转导相关基因的表达情况.结果低温胁迫后,不同浓度ABA处理的胡椒POD、CAT和SOD活性与CK相比均显著上升(P<0.05,下同),其中T2处理的POD活性升高最显著,T3处理的CAT和SOD活性升高最显著;随着ABA处理浓度的升高,H2O2和MDA含量呈先下降后上升的变化趋势,以T3处理含量最低,即一定浓度外源ABA处理对胡椒抗寒生理发挥积极作用.低温胁迫0 d时,不同ABA浓度处理的胡椒Fv/Fm和Fv/Fo无显著变化;低温胁迫4d时,其Fv/Fm和Fv/Fo均显著降低,但T3处理缓解Fv/Fm和Fv/Fo下降效果显著,即ABA预处理能够在一定程度上缓解低温对胡椒光系统潜在活性的抑制.低温胁迫0 d时,不同ABA浓度处理胡椒的qP和Yield无显著变化,但qN随着ABA处理浓度的升高明显下降,即正常生长条件下,外施不同浓度ABA对胡椒叶片的qP和Yield无影响,但会减弱胡椒的光保护能力;低温胁迫4 d时,不同ABA浓度处理的胡椒叶片qP、qN和Yield均有不同程度的下降,随着ABA处理浓度的升高,qN呈现下降、上升再下降的变化趋势,qP呈先下降后上升的变化趋势,T3处理成为转折点,即在低温胁迫下外源ABA能够提高胡椒的光保护能力,其中T3处理效果相对较好.低温胁迫条件下,ABA预处理可诱导ABA信号转导相关基因SnRK2和PYL提前并高表达.结论外源ABA通过提高胡椒抗氧化酶活性、降低H2O2和MDA含量及缓解低温对其光系统活性的伤害,从而提高胡椒抵抗低温胁迫的能力.外源ABA还能诱导胡椒ABA信号转导相关基因表达,启动和引发植株固有抗冻性基因的表达,进而提高其耐冻性.

• 鹿角蕨孢子萌发与快速繁殖技术研究

  叶秀仙, 陈艺荃, 方能炎, 吴建设, 钟淮钦,

  目的建立鹿角蕨孢子萌发与快速繁殖技术体系,为鹿角蕨规模化育苗提供技术支撑.方法以鹿角蕨孢子为外植体,采用3种不同消毒方法进行孢子灭菌与萌发;利用正交设计法,探讨基本培养基(MS、改良1号和改良2号)及植物生长调节剂(6-BA、KT、NAA和IBA)等对绿色球状体(GGB)增殖、丛生芽增殖及生根培养等关键环节的影响,筛选出适宜的孢子消毒方法及GGB增殖、丛生芽增殖和生根培养基配方.结果适宜孢子消毒的方法为超声波清洗器振荡清洗40 min,污染率低,仅为6.7%,孢子萌发率高达100.0%;各试验因素对GGB增殖影响的主次关系为基本培养基>6-BA>CH>NAA,以改良1号为基本培养基较好,6-BA适宜浓度为0.5 mg/L,NAA适宜浓度为0.1 mg/L,CH适宜浓度为0.2 g/L,42 d平均增殖系数达5.5;各试验因素对丛生芽增殖影响的主次关系为IBA>6-BA>NAA>KT,IBA适宜浓度为0.5 mg/L,6-BA适宜浓度为0.3 mg/L,KT适宜浓度为0.1 mg/L,NAA适宜浓度为0.3 mg/L,60 d平均增殖系数达5.3;添加NAA 0.3 mg/L为最适浓度,生根率为100.0%;试管苗移栽60 d成活率达98.5%.结论超声波清洗器振荡清洗40 min能有效降低鹿角蕨孢子污染率,提高孢子萌发率.鹿角蕨GGB增殖培养基以改良1号+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+CH 0.2 g/L较适宜,丛生芽增殖培养基以改良2号+6-BA 0.3 mg/L+KT 0.1 mg/L+NAA 0.3 mg/L+IBA 0.5 mg/L较适宜,生根培养基以改良1号+NAA 0.3 mg/L较适宜.

• 不同绣球切花品种采后水分变化及其影响因子分析

  顾菁菁, 张敬丽, 高俊平, 吴红芝,

  目的探索影响绣球切花采后水分平衡及品质的因子,以期为绣球切花采后保鲜提供理论依据.方法以目前市场流行的10个绣球切花品种为试验材料,于盛花期(50%小花开放)采收绣球切花,对其采后瓶插寿命及瓶插过程中鲜重变化、水分平衡变化、气孔密度、气孔开放率、萼片角质层厚度及木质化程度进行测定分析.结果不同绣球切花品种瓶插寿命差异显著(P<0.05),寿命最长达24.00 d(绿焰),最短为16.33 d(珠儿);鲜重变化率负值最早于瓶插后第3 d出现(瑞丽和钻石),最晚于第15 d出现(绿焰),鲜重变化率负值出现越晚的品种瓶插寿命越长;绣球切花瓶插期间的吸水量和失水量变化趋势一致,表明失水产生的蒸腾拉力是吸水的主要动力;不同绣球切花品种的气孔密度、气孔开放率和角质层厚度差异明显,气孔开放率总体呈先升高后下降的变化趋势(瑞丽和阿利阁除外),其差异与瓶插寿命无相关性,气孔密度和角质层是影响其水分蒸腾的两个主要方面;角质层发达的绣球切花品种寿命较长,品种热恋、绿焰和珊瑚的角质层厚度最大,分别为1.65、1.50和1.56μm,也是瓶插寿命长的品种,角质层厚度最小的珠儿(0.86μm)瓶插寿命最短;角质层不发达的绣球切花品种的瓶插寿命则受气孔的影响较大,即角质层不发达的品种中,狂想曲气孔密度较大,为24.06个/mm2,其瓶插寿命(17.67 d)短;小夜曲的气孔密度最小,为11.22个/mm2,其瓶插寿命(23.00 d)却较长;供试的10个品种萼片已具有一定程度的木质化,但品种间无明显差异.结论水分亏缺是影响绣球切花采后寿命的主要因子,蒸腾是影响水分平衡的关键因子,角质层厚度和气孔密度的差异是不同绣球切花品种盛花期采收时采后寿命差异的主要原因.

• 复合酸溶浸桑枝异槲皮苷的酸解效应

  谭双, 王星敏, 吴四维, 刘小梅,

  目的研究磷钨杂多酸复合酸催化溶浸桑枝异槲皮苷的适宜条件及其酸解作用,为提高桑枝异槲皮苷提取率和桑资源高值利用提供理论依据.方法选用磷钨杂多酸与磷酸的复合酸水热反应催化溶浸桑枝异槲皮苷,以异槲皮苷溶浸量为评价指标,采用均匀设计法优化获得复合酸溶浸桑枝异槲皮苷的适宜参数;结合扫描电子显微镜(SEM)和傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析桑枝底物形貌及表面官能团变化,解析复合酸催化效应及异槲皮苷溶浸动力学.结果投加磷钨杂多酸与磷酸的磷(P)摩尔质量比为0.42:1的复合酸327.55 mg,于165℃下水热反应100 min后,0.5000 g桑枝可溶浸异槲皮苷5.962 mg/g、多糖0.430 g/g,分别是未投加复合酸浸提时的3.17和12.29倍;反应温度和反应时间对异槲皮苷溶浸量影响极显著(P<0.01),复合酸中P摩尔质量比影响次之;FTIR测定图谱中C=C键和C-O键明显减弱,SEM扫描图谱中组织间孔隙变大,出现密集且不规整孔洞,植物组织浊蚀现象明显;异槲皮苷溶浸符合Fick第二定律的一级动力学模型,且溶浸速率常数K随反应温度的升高而增大,在反应温度为165℃时,异槲皮苷最大溶浸量为5.935 mg/g,与试验值相接近.结论复合酸溶浸桑枝异槲皮苷方法可行,升高反应温度可提高且加快异槲皮苷溶出,为桑资源高值利用提供新途径.

• 生姜黄酮乙醇浸提工艺优化及其稳定性研究

  吴存兵, 邵伯进, 吴君艳, 李家春,

  目的优化生姜黄酮乙醇浸提工艺,并对其稳定性进行研究,为发掘生姜作为高附加值产品提供科学依据.方法在单因素试验基础上,选择乙醇体积分数(A)、液料比(B)、浸提温度(C)和浸提时间(D)为影响因子,应用Box-Benhnken中心组合法进行4因素3水平试验设计,以生姜黄酮提取率(Y)为响应值进行响应面分析,并研究生姜黄酮的稳定性.结果生姜黄酮提取率对4个因素的二次方程模型为:Y=2.10-0.088A-0.10B+0.30C+0.058D-0.15AB-5.25E-003AC+0.50AD+0.19BC-0.35BD-0.13CD-0.18A2-0.23B2-0.22C2-0.24D2(R2=0.9329),响应面设计模型拟合程度较好,其中乙醇体积分数、液料比与浸提时间的交互作用对黄酮提取率有极显著影响(P液料比>乙醇体积分数>浸提时间.生姜黄酮的最佳提取工艺条件为:乙醇体积分数60%、液料比30:1、浸提温度80℃、浸泡时间3 h,在此条件下实际测得的生姜黄酮提取率为2.396%,与预测值(2.457%)接近,相对误差为2.482%.生姜黄酮在盐酸和氯化钠溶液中较稳定,而在氢氧化钠溶液中不稳定,在80℃以下时稳定性良好,温度超过80℃后出现少量降解.结论通过响应面优化的生姜黄酮乙醇浸提工艺所需设备简单、易操作、提取温度较低、污染小、耗能低且提取率较高,可用于生姜黄酮规模化提取,同时生姜黄酮可作为天然稳定剂进行开发.

• Bacillus paralicheniformis左聚糖蔗糖酶基因克隆表达及酶学性质研究

  丛豪, 罗宁, 黄飞, 梁月昭, 陈硕昌, 张声峰, 朱萍, 杨辉,

  目的从耐热菌株中克隆表达左聚糖蔗糖酶基因,以获得热稳定性较好、底物耐受性高的重组酶,为左聚糖蔗糖酶催化机理及生产应用研究提供技术基础.方法从市售菌肥中筛选耐热菌株并克隆其左聚糖蔗糖酶基因,以pSE380为载体构建重组质粒并转化至大肠杆菌诱导表达,随后通过镍亲和层析获得电泳纯的重组左聚糖蔗糖酶并研究其酶学性质.结果分离到耐热菌株LN-05,经16S rDNA序列分析鉴定为Bacillus paralicheniformis.克隆表达的B.paralicheniformis左聚糖蔗糖酶与已公布地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)RN-01的左聚糖蔗糖酶存在19个氨基酸残基差异.重组酶催化水解反应最适pH为6.0,最适温度为45℃,于40和45℃保温3 h后残余酶活力分别为89%和78%.Mn2+、Ag3+和Cr2+对重组左聚糖蔗糖酶的水解活力有明显抑制作用,Co2+和Al3+对水解活力具有一定促进效果;Ba2+、Mg2+和Mn2+对聚合活力有明显抑制作用,Ag3+、Cu2+和K+对聚合活力具有促进作用.EDTA对重组酶水解活力和聚合活力均具有抑制作用.在最适条件下,重组左聚糖蔗糖酶的最大反应速率(Vmax)=74μmol/(min·mg),米氏常数(Km)为7.57 mmol/L.催化聚合反应的最适温度随着底物蔗糖浓度而变化,当蔗糖浓度为50%时,最适温度为40℃;最适聚合反应pH为5.0;当酶浓度为0.9 U/mL,在最适条件下反应24 h,左聚糖产糖量达183.00±1.73 g/L,蔗糖转化率为(36.76±1.84)%.结论B.paralicheniformis左聚糖蔗糖酶的热稳定性较好,左聚糖产量高,具有转化蔗糖生产高附加值左聚糖的应用潜力.

• 群体感应淬灭酶YtnP对草鱼肠道菌群结构的影响

  赵祯, 肖翎, 戚建华, 刘韵怡, 王年, 郁小娟, 宋增福,

  目的揭示群体感应淬灭作用与宿主肠道菌群结构间的作用关系,为具有群体感应淬灭作用益生菌及其淬灭酶在水产养殖上的推广应用提供理论依据.方法选取30尾规格为25±1 g/尾的草鱼随机分为对照组和试验组,试验组每尾草鱼腹腔注射100μL溶解稀释后的YtnP(25μg/mL),对照组每尾草鱼腹腔注射等量的300 mmol/L分子筛缓冲液,分别在注射后24和48 h采集草鱼前肠、中肠和后肠的肠道组织及内容物,提取各肠段总DNA及PCR扩增16S rRNA序列V3~V4可变区,然后基于Illumina MiSeq高通量测序技术分析外源添加YtnP对草鱼肠道菌群多样性与丰度的影响.结果12份草鱼肠道样品测序共获得原始序列(Raw reads)660205条,有效序列(Valid reads)416614条;对照组和试验组样品的OTU数目分别为142±102和143±67个.在门分类水平上,对照组和试验组草鱼肠道优势菌群均为放线菌门(Actinobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes);相对于对照组,试验组草鱼肠道中浮霉菌门(Planctomycetes)相对丰度显著增加(P0.05,下同),厚壁菌门、TM7和拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度则呈下降趋势.在属分类水平上,对照组和试验组草鱼肠道均以鲸杆菌属(Cetobacterium)和诺卡氏菌属(Nocardia)为优势菌群;相对于对照组,试验组草鱼肠道中鲸杆菌属相对丰度呈升高趋势、诺卡氏菌属相对丰度呈下降趋势,但变化差异均不显著,未特指微杆菌属(Unspecified_Microbacteriaceae)相对丰度则显著增加.草鱼肠道菌群结构Alpha多样性分析发现,试验组样品的Chao1和ACE指数低于对照组样品,Shannon和Simpson指数略高于对照组样品,但差异均不显著;Beta多样性分析结果显示,对照组与试验组间的菌群特点存在差异,且组间区分效果明显.结论外源添加YtnP不会导致草鱼肠道优势菌群种类发生明显变化,但能在一定程度影响肠道菌群的相对丰度.

• 七彩神仙鱼脑组织转录组mRNAs差异表达分析

  刘怡南, 温彬, 陈再忠,

  目的挖掘七彩神仙鱼(Symphysodon haraldi)脑组织性别差异基因,为揭示脑组织性别相关基因调控繁殖生理机制打下基础.方法利用Illumina HiSeq 6000测序平台对七彩神仙鱼雌、雄脑组织样本进行转录组测序分析,经过滤和Trinity组装获得基因,采用DIAMOND进行功能注释;并选取NR、GO、KEGG、Pfam、Swiss-Prot和egg-NOG等数据库进行比对,筛选出差异表达候选基因;随机选取6个差异表达基因进行实时荧光定量PCR验证.结果从构建的七彩神仙鱼脑组织cDNA文库测序获得337190200条原始数据(Raw reads),经质量筛选后获得34109个基因(平均长度1007.00 bp)和67488个转录本(平均长度694.00 bp).经生物信息学分析方法筛选,最终获得85个差异表达基因(61个在雄鱼脑组织中高表达,24个在雌鱼脑组织中高表达),包括黑色素浓集激素(MCH)、催乳素释放激素(Prlh)、垂体同源结构域转录因子2(pitx2)、免疫球蛋白家族成员(DSCAM和IGDCC3)、溶质载体(UNC93B1)及醛糖还原酶(AKR1B1)等功能基因.与雌鱼脑组织相比,雄鱼脑组织中涉及细胞突触传递、激素调控、信号传导、黑色素浓集激素、催乳素释放激素、生长激素和G蛋白偶联受体的基因呈下调趋势,而涉及离子运输和免疫反应的基因呈上调趋势.随机选取6个差异表达基因(Prlh、pitx2、MCH、LMX1A、KBP和CRP)进行实时荧光定量PCR验证,结果显示,Prlh、pitx2、MCH、LMX1A和KBP基因在雌鱼脑组织的相对表达量较高,而CRP基因在雄鱼脑组织的相对表达量较高.结论MCH、Prlh、pitx2、DSCAM、IGDCC3、UNC93B1、AKR1B1和Nid1等基因在七彩神仙鱼脑组织中呈性别差异表达,可能在调节脑组织类固醇激素形成及配子发生的过程中发挥重要作用,可作为候选基因应用于七彩神仙鱼脑组织性别相关基因调控繁殖生理机制研究.

• 基于生长和抗逆功能基因SNP分子标记的凡纳滨对虾野生及选育群体遗传多样性分析

  申淑慧, 戴习林,

  目的分析凡纳滨对虾野生群体与选育群体的遗传多样性及遗传差异,为进一步改良优化凡纳滨对虾种质提供参考依据.方法通过凡纳滨对虾转录组测序数据挖掘候选SNP位点,设计扩增引物,采用10尾野生凡纳滨对虾进行直接测序验证,筛选获得11对有效引物及24个位于生长和抗逆功能基因上的SNPs位点,并用于分析2个野生群体(Y1和Y2)和2个选育群体(F1和F2)的遗传多样性.结果凡纳滨对虾野生群体的观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)及多态信息含量(PIC)等遗传参数平均值明显高于选育群体.在2个野生群体中,Y2的各项遗传参数平均值均高于Y1;在2个选育群体中,F2的各项遗传参数平均值均高于F1,且在CATL、ANT、Tryptase、Crustin-like和Penaeidin4c等功能基因的某些SNP位点上,2个选育群体的各项遗传参数平均值为0.4个凡纳滨对虾群体中均存在SNP位点不同程度偏离Hardy-Weinberg平衡现象.野生群体Y1与选育群体F1间的近交系数(Fis)最高(0.0875),且基因流(Nm)也较高(4.2728);野生群体Y2与选育群体F1间的遗传分化指数(Fst)最高(0.0947),但Nm最低(2.3886),表明二者间的遗传背景较远.4个凡纳滨对虾群体的遗传变异主要来源于群体内(85.15%),仅有14.85%变异来源于群体间.4个凡纳滨对虾群体的遗传相似性系数为0.9351~0.9747,遗传距离为0.0256~0.0671;基于凡纳滨对虾群体遗传距离的UPG-MA聚类分析结果显示,Y1、F1和F2聚为一支,而Y2单独聚为一支.结论凡纳滨对虾野生群体在抗逆功能基因SNP分子标记中的遗传多样性显著高于选育群体,且野生群体与选育群体间的遗传距离较远,具有较高的遗传改良潜力.在实际生产中,可通过杂交措施将野生群体的优良抗逆基因引入选育群体,提高凡纳滨对虾选育群体的免疫及抗病能力.

• 拟穴青蟹致病性副溶血弧菌分离鉴定及药敏试验

  陈小龙, 程长洪, 邓益琴, 马红玲, 苏友禄, 冯娟, 郭志勋,

  目的确定引起拟穴青蟹发病死亡的病原菌,并了解其致病性及药敏特性,为该病的临床诊断及科学防控提供理论依据,同时为保障拟穴青蟹养殖业的健康发展打下基础.方法采用常规细菌分离纯化方法从患病拟穴青蟹的病料组织中分离优势菌株,通过形态特征观察、生理生化特性鉴定及16S rDNA序列分析进行分类学鉴定,并进行人工感染试验、组织病理学观察及药敏特性分析.结果从患病拟穴青蟹肝胰腺中分离得到1株优势菌株(编号NS1SP18),菌株NS1SP18感染拟穴青蟹48 h的半数致死剂量(LD50)为3.18×104 CFU/g,感染发病拟穴青蟹呈现出多体液、偶有黑鳃及肝胰腺暗黄等症状,与自然发病拟穴青蟹的症状相似.综合菌株NS1SP18的形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析结果,可鉴定为副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus).患病拟穴青蟹的肝胰腺细胞发生变性;心肌纤维肿大,细胞坏死,有血淋巴浸润;网状鳃腔结构消失,脱落细胞阻塞鳃腔;肌纤维形变、断裂,局部坏死.菌株NS1SP18对氟苯尼考、恩诺沙星、四环素、多四环素、诺氟沙星、复方新诺明和庆大霉素等7种抗生素敏感,对麦迪霉素、万古霉素和阿莫西林已产生耐药性;对诃子、乌梅、苏木和八角茴香等4味中药极敏,对地榆、女贞子、山楂、五倍子、黄连、半枝莲、赤芍和救必应等8味中药高敏,对应的最小抑菌浓度(MIC)为7.81~31.25 mg/mL,最小杀菌浓度(MBC)为15.62~125.00 mg/mL.结论从患病拟穴青蟹分离获得的副溶血弧菌具有较强致病性,能造成严重的组织损伤而导致拟穴青蟹发病死亡.在拟穴青蟹养殖生产中,可适度选用氟苯尼考和恩诺沙星等抗生素抑制副溶血弧菌病暴发流行,或以诃子、乌梅、苏木和八角茴香等中药进行副溶血弧菌病防治.

• 人工添加酵母硒对吉富罗非鱼肌肉蛋白、脂肪及氨基酸的影响

  李柳清, 罗永巨, 肖俊, 黄一帆, 阴晴朗, 王志芳, 檀午芳,

  目的明确在日粮中人工添加酵母硒对吉富罗非鱼肌肉营养成分的影响,为开发生产优质的富硒吉富罗非鱼产品提供科学依据.方法以含不同浓度0(对照)、3、5和10 mg/kg酵母硒的日粮投喂吉富罗非鱼,日投喂量为鱼体重的2.5%~3.0%,连续投喂28 d后统一投喂普通饲料7 d.于饲养第35 d采集吉富罗非鱼背部肌肉,从肌肉蛋白、氨基酸及硒含量等角度对比分析酵母硒对吉富罗非鱼肌肉营养成分的影响,并采用国际通用的营养评价方法评估其营养价值.结果日粮中添加酵母硒可提高吉富罗非鱼肌肉粗蛋白含量及降低粗脂肪含量.4组吉富罗非鱼肌肉中均检测出17种氨基酸,含量最高的是谷氨酸(Glu),其次是天冬氨酸(Asp)、赖氨酸(Lys)和亮氨酸(Leu),含量最低的是半胱氨酸(Cys);均以鲜味氨基酸和甜味氨基酸为主,且各酵母硒处理组吉富罗非鱼高于对照组吉富罗非鱼.4组吉富罗非鱼肌肉中所含的必需氨基酸比例均符合FAO/WHO理想模式,其中以3 mg/kg处理组的必需氨基酸总量/氨基酸总量(∑EAA/∑TAA)和必需氨基酸总量/非必需氨基酸总量∑EAA/∑NEAA最高,分别为40.58%和68.31%.以氨基酸评分(AAS)和化学评分(CS)为标准,4组吉富罗非鱼肌肉的第一、第二限制性氨基酸种类相同,对应的评分略有不同,但均以10 mg/kg处理组更接近于对照组.综合必需氨基酸指数(EAAI)、生物价(BV)和营养指数(NI)3项评价指标,吉富罗非鱼肌肉的营养价值排序为3 mg/kg处理组>5 mg/kg处理组>10 mg/kg处理组>对照组.各酵母硒处理组吉富罗非鱼肌肉硒含量均显著高于对照组吉富罗非鱼(P<0.05),分别为0.440±0.025、0.457±0.018和0.458±0.026 mg/kg,符合富硒水产品标准.结论吉富罗非鱼日粮中人工添加酵母硒可降低其肌肉脂肪含量,增加总氨基酸和优质蛋白含量,丰富其鲜味及甜味氨基酸含量,并增加肌肉硒含量.其中以日粮中添加3 mg/kg酵母硒的效果最佳.