南方农业学报

作者：谭红连, 韦剑成, 李莉萍, 童桂香, 苏美珍, 韦信贤, 杨明伟, 陈静,

关键词：大口黑鲈, 鳜, 虹彩病毒（RanaV）, 传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）, 鲈形目鱼类弹状病毒（PFRV）, 三重荧光定量PCR,

目的 建立能同时检测鲈鳜虹彩病毒（RanaV）、传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）和鲈形目鱼类弹状病毒（PFRV）的三重荧光定量PCR，为鲈鳜养殖过程中的RanaV、ISKNV、PFRV检疫、监测及临床诊断等提供简便且高效的检测方法。方法 分别根据RanaV-MCP基因、ISKNV-MCP基因、PFRV-G基因的保守序列设计特异性扩增引物和TaqMan-MGB探针，将目的基因片段克隆至pGM-T载体上构建重组质粒pGM-T-MCPRanaV、pGM-T-MCPISKNV和pGM-T-GPFRV，其中，pGM-T-MCPRanaV、pGM-T-MCPISKNV分别作为RanaV和ISKNV的标准品DNA，pGM-T-GPFRV则以SalⅠ酶切后经体外转录获得PFRV标准品RNA；以标准品为模板进行三重荧光定量PCR反应条件优化及标准曲线制定，并分别进行敏感性、特异性、重复性及临床应用试验。结果 优化后的三重荧光定量PCR反应体系30.0 μL：2×Fast One Step Probe RT-qPCR Mix 15.0 μL，引物RanaV-qF/RanaV-qR（10 μmol/L）、ISKNV-qF/ISKNV-qR（10 μmol/L）、PFRV-qF/PFRV-qR（10 μmol/L）各0.6 μL，探针RanaV-qP（5 μmol/L）0.9 μL，探针ISKNV-qP（5 μmol/L）0.9 μL，探针PFRV-qP（5 μmol/L）1.2 μL，核酸模板3.0 μL，灭菌DEPC水补足至30.0 μL。建立的三重荧光定量PCR对RanaV、ISKNV和PFRV标准品均具有较高的扩增效率（Eff.>95.0%），其标准曲线线性关系良好（RSq≥0.999），可实现对RanaV、ISKNV和PFRV的同步定量分析；对RanaV、ISKNV、PFRV标准品的检测灵敏度可达10 copies/反应，对鲈鳜组织样品的检测灵敏度为10 copies/mg；与草鱼呼肠孤病毒（GCRV）、罗非鱼湖病毒（TiLV）、鲤春病毒血症病毒（SVCV）等鱼类常见病原均无交叉反应；检测RanaV、ISKNV、PFRV的组内及组间重复试验的Ct值变异系数均低于2.00%。采用建立的三重荧光定量PCR对采自广西各地养殖场的鲈鳜样品（大口黑鲈95份，鳜68份）进行检测，结果发现，RanaV阳性检出率为19.0%，ISKNV阳性检出率为14.7%，PFRV阳性检出率为4.3%。结论 基于TaqMan-MGB探针建立的三重荧光定量PCR能同时检测RanaV、ISKNV和PFRV，具有灵敏度高、特异性强、准确可靠、操作简单、快速高效的特点，可为鲈鳜的苗种检疫、疫情监测及临床诊断提供更简便、更高效的技术手段。RanaV、ISKNV和PFRV感染在广西鲈鳜养殖中已流行，大口黑鲈以RanaV感染为主，鳜则以ISKNV感染为主，且存在混合感染及无临床症状的潜伏感染。

来源：2025年第8期

《南方农业学报》期刊编辑部

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