南方农业学报

作者：刘璎慧, 蒋丽, 雷静, 刘祎, 王顺哲, 杨倩, 孙浩然, 范静, 张俊杰,

关键词：白斑狗鱼, <i>zpax4</i>基因, 表达特征, 基因敲除, CRISPR/Cas9,

【目的】 探究ZP基因家族中zpax4基因在白斑狗鱼性腺生长发育中的表达情况，利用CRISPR/Cas9技术建立白斑狗鱼zpax4基因敲除模型，为后续探究其生物学功能提供参考依据。【方法】 利用RACE克隆白斑狗鱼zpax4基因的全长cDNA序列，利用生物信息学软件进行zpax4蛋白理化性质、结构特点和系统进化分析；应用实时荧光定量PCR分析zpax4基因在白斑狗鱼126、180和320 d 3个时期8个组织中的相对表达量；设计并筛选合适的sgRNA，通过对受精卵的显微注射，建立白斑狗鱼zpax4基因的CRISPR/Cas9敲除模型，并对获得的F0代敲除嵌合体进行组织切片观察。【结果】 白斑狗鱼zpax4基因c DNA全长2771 bp，其中，5'非编码区（5'-UTR）为162 bp,3'非编码区（3'-UTR）为150 bp。zpax4基因编码811个氨基酸残基，蛋白分子式C4117H6364N1092O1209S39，理论分子量为91.752 kD，理论等电点（pI）为5.43，且编码蛋白N端有信号肽序列，靠近C端有ZP结构域，无跨膜结构域，其二级结构由α-螺旋（14.3%）、无规则卷曲（54.5%）和延伸链（31.2%）构成。多序列比对和系统发育树分析显示，白斑狗鱼zpax4蛋白与其他几种鱼类的zpax4蛋白氨基酸序列相似性为54.85%，功能结构域位置相对保守。实时荧光定量PCR检测结果显示，白斑狗鱼zpax4基因在肠道、肌肉、鳃、头肾、肾脏、肝脏和精巢中基本无表达，而在3个时期的卵巢中均呈极显著表达（P&lt;0.01），且卵巢中相对表达量在126、180和320 d 3个时期呈先增后减的变化趋势，180 d相对表达量最高；此外，在320 d雄鱼的脑组织中也有一定量的表达。利用CRISPR/Cas9技术筛选得到合适的sgRNA，并成功建立白斑狗鱼zpax4基因敲除模型，得到多种突变类型个体，缺失碱基数分别为1、4、7和8，均不为3的倍数。对F0代嵌合体鱼苗进行整鱼切片分析，并未发现明显的性腺及其他部位的表型异常。【结论】 利用CRISPR/Cas9技术对白斑狗鱼zpax4基因进行敲除，成功构建了敲除模型，获得白斑狗鱼zpax4基因敲除嵌合体，并筛选出更优的sgRNA靶点序列。zpax4基因可能在白斑狗鱼卵巢发育的前中期发挥重要作用。

来源：2025年第6期

《南方农业学报》期刊编辑部

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