南方农业学报

作者：陈林, 孙彤彤, 吴文德,

关键词：罗非鱼, IgT, 原核表达, 单克隆抗体,

【目的】制备具有活性的罗非鱼IgT重链单克隆抗体，为研究罗非鱼黏膜免疫应答提供基础材料。【方法】取无乳链球菌感染的吉富罗非鱼脾脏组织，提取总RNA。采用PCR扩增罗非鱼IgT重链恒定区CH2基因片段，构建原核表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组蛋白并用NiAgaroseResin进行纯化。以重组蛋白免疫6～8周龄BALB/c小鼠，经4次免疫后，取小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）进行融合。利用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选阳性杂交瘤细胞株，并通过间接ELISA与Western blotting检测对单克隆抗体亚型、效价和特异性进行鉴定。【结果】扩增获得长度约546 bp的IgT重链恒定区CH2基因片段，成功构建原核表达载体pET-32a(+)-IgT，在终浓度为1 mmol/L IPTG诱导下，获得分子量约38.3 kD的重组蛋白，以包涵体形式表达。以纯化的重组蛋白免疫小鼠，经测定血清抗体效价为1∶1280000以上，满足细胞融合要求。筛选获得4株能稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株，其中2B11保藏于中国典型培养物保藏中心（保藏号：C2023390），单克隆抗体亚型鉴定结果表明，2B11重链为IgG2b型，制备的小鼠腹水抗体纯化前效价为1∶16000，纯化后效价为1∶8000。Westernblotting检测结果表明，制备的单克隆抗体能特异性识别罗非鱼皮肤黏液中大小约42kD的天然IgT。【结论】成功制备了具有活性的抗罗非鱼IgT单克隆抗体，可用于检测罗非鱼经病原微生物感染或疫苗接种后产生的抗体。

来源：2024年第12期

《南方农业学报》期刊编辑部

查看南方农业学报杂志2024年第12期