南方农业学报

作者：段辰星, 黄袁慧, 闵开骏, 李晓宁, 罗廷荣,

关键词：鼠源<i>ATP5B</i>基因, 基因克隆, 生物信息学分析, 表达载体构建,

【目的】 克隆鼠源ATP5B基因，构建其原核和真核表达载体，为研究ATP5B蛋白功能及其在病毒感染过程中的作用机制提供基础。【方法】 克隆鼠源ATP5B基因编码区（CDS），运用ProtParam、ProtScale和SignalP-5.0等对ATP5B蛋白进行生物信息学分析。采用同源重组方法构建原核表达载体pGEX-4T-1-ATP5B-Flag和真核表达载体pcDNA3.0-ATP5B-Flag。以原核表达载体pGEX-4T-1-ATP5B-Flag转化大肠杆菌BL21感受态细胞，利用IPTG进行诱导表达，分析最适诱导温度和IPTG浓度。以真核表达载体pcDNA3.0-ATP5B-Flag转染HEK-293T细胞，通过Western blotting和间接免疫荧光试验（IFA）检测ATP5B蛋白在细胞中的表达及分布情况。【结果】 鼠源ATP5B基因CDS长1590 bp，鼠源ATP5B蛋白由529个氨基酸残基构成，分子量为55 kD，理论等电点（pI）为5.21，属于稳定的疏水性蛋白，无跨膜结构域和信号肽，不属于分泌蛋白；鼠源ATP5B蛋白二级结构中α-螺旋占43.67%，无规则卷曲占32.51%,β-转角占9.45%，延伸链占14.37%。原核表达载体pGEX-4T-1-ATP5B-Flag经IPTG诱导后，通过考马斯亮蓝染色和Western blotting在81 kD处成功检测到融合蛋白，且主要以包涵体形式表达，诱导条件以30℃、0.5 mmol/L IPTG的效果更好。以真核表达载体pcDNA3.0-ATP5B-Flag转染HEK-293T细胞后，在55 kD处检测到Flag标签特异性条带，即ATP5B蛋白在HEK-293T细胞中成功表达，IFA检测结果表明该蛋白主要定位在细胞质中。【结论】 成功构建鼠源ATP5B基因原核和真核表达载体，原核表达载体表达出的融合蛋白主要以包涵体形式存在，只有少量可溶蛋白，真核表达的ATP5B蛋白主要定位在细胞质中。鼠源ATP5B蛋白是理化性质稳定的疏水性蛋白，无信号肽位点，不属于分泌蛋白。

来源：2024年第6期

《南方农业学报》期刊编辑部

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