南方农业学报

作者：赵梓桥, 张昆丽, 张春红, 翟少伦, 康欣桐, 黄淑坚, 张建峰,

关键词：猪德尔塔冠状病毒(PDCoV), N蛋白, 原核表达, 多克隆抗体,

【目的】 构建猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）核衣壳（N）蛋白原核表达系统并制备多克隆抗体，为新型疫苗、诊断试剂研发及PDCoV致病机制的深入研究提供基础。【方法】 提取PDCoV HeN17株RNA，经RT-PCR扩增，将N基因克隆至pGEX-6P-1载体构建重组原核表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行IPTG诱导表达。利用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化重组蛋白，采用3C蛋白酶去除标签。以纯化后的N蛋白为免疫原免疫3月龄新西兰大白兔制备多克隆抗体，采用间接酶联免疫吸附测定（ELISA）法测定抗体效价，并通过Western blotting、间接免疫荧光试验（IFA）和免疫沉淀（IP）试验对其进行鉴定。【结果】 成功构建原核表达载体pGEX-6p-1-PDCoV-N，获得的PDCoV-N-GST重组蛋白主要以可溶性形式表达，大小约69k D，经去除GST标签可获得单一目的蛋白条带，经测定蛋白浓度为12.6 mg/mL，获得的PDCoV-N蛋白能与PDCoV阳性血清反应产生单一特异性条带。制备的兔源抗PDCoV-N多克隆抗体效价达1∶4096000，可特异性识别p CAGGS-Flag-N转染HEK-293T细胞中表达的Flag-N蛋白和PDCoV感染LLC-PK1细胞中表达的PDCoV-N蛋白，且能检测到PDCoV-N真核表达载体pCAGGSFlag-N转染HEK-293T细胞中表达的PDCoV-N蛋白。【结论】 成功构建高效PDCoV-N原核表达系统，获得纯度好、浓度高且免疫原性佳的PDCoV-N蛋白，制备的兔源抗PDCoV-N多克隆抗体效价高，具有较强亲和力和特异性，可用于Western blotting、IFA和IP检测。

来源：2024年第6期

《南方农业学报》期刊编辑部

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