南方农业学报

作者：孙玲玲, 黄振文, 田奎, 张嘉乐, 郑基坛, 濮黎萍, 陆阳清,

关键词：鸡, 原始生殖细胞(PGCs), iCaspase9, 基因编辑, 细胞消除,

【目的】制备在生殖细胞特异表达iCaspase9的鸡原始生殖细胞系（PGCs），提升外源性PGCs的生殖传递效率，为生产诱导不育的雄性或雌性受体鸡胚打下基础。【方法】利用piggyBac转座子将iCaspase9片段整合到鸡基因组中，构建稳定转染iCaspase9片段的CAG-iCaspase9-mCherry DF-1细胞系，通过荧光微显镜观察鉴定其在iCaspase9系统诱导底物B/B二聚化配体作用下的细胞消除效果；再利用CRISPR/Cas9技术将iCaspase9片段定点插入DAZL基因第11外显子之后构建Dazl-iCaspase9-EGFP PGCs，经iCaspase9片段插入鉴定和PGCs生殖特性鉴定后，通过荧光微显镜观察鉴定其在B/B二聚化配体诱导下的消除效果。【结果】成功建立的CAG-iCaspase9-mCherry DF-1细胞系与野生型DF-1细胞（WT DF-1）的生长增殖无显著差异（P>0.05，下同）；CCK-8法测定发现，0.25~5.00 nmol/L B/B二聚化配体对WT DF-1细胞生长数量无显著影响，但CAG-iCaspase9-mCherry DF-1细胞在添加B/B二聚化配体后，细胞数量较空白对照组极显著降低（PCvh、Nanog、PouV、DAZL、Cdh和Ddx4等生殖细胞相关基因，在蛋白水平上也能鉴定出DAZL、SSEA1和CVH等蛋白，说明插入iCaspse9片段后并没有改变生PGCs的殖细胞特异性；在0.25 nmol/L B/B二聚化配体诱导作用下，DAZL-iCaspae9-EGFP PGCs数量显著减少，几乎全部消除，说明iCaspase9系统可诱导细胞凋亡而有效消除内源性PGCs。【结论】利用iCaspase9系统构建获得的DAZL-iCaspase9-EGFP PGCs在不改变其生殖细胞特性的同时，可在B/B二聚化配体诱导下有效消除内源性PGCs，为建立高效鸡种质资源恢复和基因编辑鸡制备等研究提供无内源性PGCs的受体鸡胚。

来源：2023年第11期

《南方农业学报》期刊编辑部

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