南方农业学报

作者：李梦茹, 张文, 段辰星, 马良, 栗朵朵, 彭璟, 梁晶晶, 罗廷荣, 李晓宁,

关键词：鼠源, 真核生物翻译起始因子(eIFs), <i>eIF4A1</i>基因, 原核表达, 真核表达, 生物信息学分析,

【目的】克隆昆明小鼠真核生物翻译起始因子4A1基因(eIF4A1)并构建其原核/真核表达载体,探究其结构和生物学特性,为在体内外鉴定e IF4A1互作蛋白网络打下基础。【方法】以昆明小鼠脑组织总RNA反转录合成的cDNA为模板,PCR扩增鼠源e IF4A1基因编码区(CDS)序列,然后克隆到pGEX-4T-1和pcDNA3.0载体上分别构建原核/真核表达载体;利用大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞对原核表达载体进行诱导表达、纯化及鉴定;同时以真核表达载体转染HEK-293T细胞,通过Western blotting和间接免疫荧光(IFA)检测eIF4A1蛋白在HEK-293T细胞内的表达及分布情况;并以ProtParam、ProtScale、TMHMM-2.0、SignalP-5.0、SOPMA和SWISS-MODEL等在线软件对鼠源eIF4A1蛋白进行生物学信息分析。【结果】鼠源eIF4A1基因CDS序列长1221 bp,克隆到pGEX-4T-1载体能成功构建原核表达载体pGEX-4T-eIF4A1-Flag,在25和30℃下经0.5 mmol/L IPTG诱导均能大量表达出融合蛋白eIF4A1-Flag,且主要以包涵体形式存在。将鼠源eIF4A1基因克隆至pcDNA3.0载体成功构建获得真核表达载体pcDNA3.0-eIF4A1-Flag,以其转染HEK-293T细胞后,eIF4A1蛋白在HEK-293T细胞中成功表达,且主要分布在细胞质中。生物信息学分析结果表明,eIF4A1蛋白相对分子量为46.15408 kD,理论等电点(pI)为5.267,含有407个氨基酸残基;属于不稳定的亲水性非分泌蛋白,无跨膜结构,也没有信号肽,其二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。鼠源eIF4A1蛋白的主要互作蛋白有10个,除eIFs家族蛋白外,还包括Paip1和Pdcd4互作蛋白。【结论】eIF4A1主要是分布在细胞质,为不稳定的亲水性非分泌蛋白,无跨膜结构和信号肽,通过构建原核/真核表达载体表达获得的融合蛋白eIF4A1-Flag可用于筛选和鉴定eIF4A1互作蛋白,为深入探究eIFs的结构及生物学功能提供技术支持。

来源：2023年第10期

《南方农业学报》期刊编辑部

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