南方农业学报

作者：杨倩, 王顺哲, 刘璎慧, 刘祎, 汪泳昌, 李胜忠, 张俊杰,

关键词：斑马鱼, <i>gdnfa</i>基因, 精巢, 表达特征, CRISPR/Cas9,

【目的】明确gdnfa基因在斑马鱼中的表达特征及其进化保守性,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立gdnfa+/-F1代杂合突变体,为后续生成gdnfa-/-F2代纯合突变体打下基础,同时为探讨gdnfa基因在斑马鱼性腺分化和发育中的作用机制提供理论依据。【方法】通过下载不同物种的GDNF蛋白氨基酸序列,并分析其保守结构域,探究该基因在不同物种中的进化保守性。利用实时荧光定量PCR检测gdnfa基因在6月龄斑马鱼不同组织中的表达情况,并通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得gdnfa F0代突变个体,随后与野生型回交获取gdnfa+/-F1代突变个体,并分析其基因型及突变类型。最后,通过组织石蜡切片分析3月龄gdnfa+/-F1代个体与同期野生型性腺组织间的差异。【结果】斑马鱼GDNFA蛋白分子量为26.89 kD,由235个氨基酸残基组成,包含13个疏水氨基酸和51个酸性氨基酸,理论等电点(pI)为8.455,且该蛋白存在1个TGF-β结构域。斑马鱼GDNFA蛋白序列进化较保守,与非洲爪蟾、小鼠和人类GDNFA蛋白具有相同的TGF-β结构域,推测GDNFA蛋白序列在鱼类、人类和爬型动物类中进化保守。gdnfa基因在6月龄斑马鱼的性腺(精巢和卵巢)、肾脏、肝脏、鳃和肌肉组织中均有表达,但精巢中gdnfa基因的相对表达量显著高于其他组织(P&lt;0.01)。繁育得到的48尾斑马鱼gdnfa+/-F1代杂合突变体中产生了3种突变类型,分别为在靶点附近插入2个碱基(△+2 bp)、缺失2个碱基(△-2 bp)和缺失12个碱基(△-12 bp)。48尾gdnfa+/-F1代个体的雄性∶雌性=14∶34,呈现出明显的雌性性别偏向。与野生型斑马鱼GDNFA蛋白相比,斑马鱼gdnfa+/-F1代个体的GDNFA蛋白三级结构发生了明显变化。性腺石蜡切片观察发现,部分gdnfa+/-F1代个体(△-2 bp)精巢中A型精原细胞团减少,B型精原细胞团排列更疏松;部分个体(△-12 bp)卵巢中更多的皮质泡卵母细胞累积。【结论】斑马鱼gdnfa基因与其他硬骨鱼类平行进化,且gdnfa基因在硬骨鱼类的进化过程中具有高度保守性;由于gdnfa基因在斑马鱼精巢发育中发挥作用,故gdnfa+/-F1代个体性别比例偏向于雌性,推测其参与斑马鱼性别分化。gdnfa+/-F1代杂合体部分功能的缺失对精原细胞的产生、皮层滤泡期卵母细胞到初级生长期卵母细胞的过渡阶段起到阻滞作用。获得的gdnfa+/-F1代个体可用于生成gdnfa-/-F2代纯合个体。

来源：2023年第9期

《南方农业学报》期刊编辑部

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