南方农业学报

作者：张菊, 杨志芬, 穆远杭, 石鹿溪, 张庆勤, 张素勤,

关键词：小偃麦, 酵母双杂交（Y2H）, TtLEA2-1, 互作蛋白, 盐胁迫,

【目的】构建小偃麦酵母双杂交（Y2H）文库，筛选胚胎发育晚期丰富蛋白（TtLEA2-1）的互作蛋白，为探究该基因的功能和表达调控机理提供理论参考。【方法】以小偃麦Y1805为材料，经提取RNA、分离mRNA、cDNA合成和均一化（DSN）处理后进行BP （attB和attP位点）重组反应，把重组产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，构建cDNA初级文库。抽提初级文库质粒，以pGADT7-DEST载体进行LR （attL或attR位点）重组反应，再转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，构建Y2H文库。【结果】对初级文库和Y2H文库进行质量分析，其滴度分别是3.98×106 CFU/mL和6.14×106CFU/mL，库容量分别为7.96×106 CFU和1.23×107 CFU，重组率均为100%。从Y2H文库中挑取的24个单克隆的插入片段长度为850~4000 bp，平均片段长度大于1000 bp。采用Y2H技术和回转验证试验，从小偃麦Y2H文库中筛选了48个可能与TtLEA2-1互作的蛋白。48个TtLEA2-1互作蛋白中，有7个互作蛋白富集在遗传信息处理通路，4个蛋白富集在蛋白质家族：遗传信息过程通路，4个蛋白富集在核苷酸代谢通路，3个蛋白富集在甘氨酸生物合成和代谢通路，2个蛋白富集在碳水化合物代谢通路；富集在蛋白质家族：代谢、细胞过程、环境信息处理、氨基酸代谢通路的蛋白各有1个。【结论】构建的Y2H文库质量高、完整性好和覆盖面广，成功用于小偃麦盐胁迫响应基因互作蛋白的筛选试验，也为新基因发掘及其表达调控机理研究提供高效、便捷途径。

来源：2023年第4期

《南方农业学报》期刊编辑部

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