南方农业学报

作者：喻娇, 曹馨, 唐青海, 侯鑫军, 高翠翠, 韩涛涛, 黎露, 刘会敬, 唐斯萍,

关键词：犬ELF4蛋白, 原核表达, 真核表达, 佐剂, 卵黄抗体,

【目的】克隆犬转录因子ELF4基因（cELF4），体外表达重组cELF4蛋白（rcELF4）并制备抗该蛋白的卵黄抗体（IgY），为深入探究犬ELF4蛋白功能提供基础材料。【方法】采用RT-PCR扩增cELF4基因，将目的基因克隆至pMD19-T载体构建重组质粒并测序，运用生物信息学软件分析其核苷酸序列及编码的氨基酸序列特征。将cELF4基因克隆至原核表达载体pET-28a，构建重组表达质粒pET28a-cELF4，分别转化大肠杆菌BL21（DE3）和Rosetta（DE3）感受态细胞，诱导表达后对表达产物进行SDS-PAGE检测和Western blotting鉴定。将rcELF4蛋白分别与3种免疫佐剂（ISA 15AVG、 ISA 71VG、 ISA 201VG）乳化制备免疫原，通过免疫蛋鸡检测抗体滴度和IgY含量。构建真核重组表达载体pEGFP-cELF4，转染细胞后，利用免疫过氧化物酶细胞单层试验（IPMA）分析cELF4特异性IgY的免疫活性。【结果】cELF4基因（GenBank登录号MZ198105）的开放阅读框（ORF）为1992 bp，编码663个氨基酸残基。cELF4基因与狐ELF4基因的核苷酸相似性最高 （99.3%），而与小鼠的相似性最低 （81.5%）。结合系统进化结果发现， cELF4基因与狐、大熊猫、欧洲雪貂、北美水獭等动物ELF4基因的亲缘关系较近，而与人和猴等灵长类动物及啮齿类鼠ELF4基因的亲缘关系相对较远。rcELF4蛋白分子量大小约100 kD，可刺激鸡产生相应抗体， ISA 15AVG、 ISA 71VG和ISA201VG组血清抗体滴度均在首免后38 d达峰值，其中ISA 201VG组效价最高 （>128000倍），且3组rcELF4特异性IgY抗体均在首免后14 d转阳，首免后35 d达峰值，其中ISA 201VG组血清抗体滴度最高，为256000倍。3组鸡蛋卵黄中所提取的IgY含量最高值为4.09 mg/10 mL卵黄液，与rcELF4蛋白呈特异性反应、且与人ELF4蛋白存在交叉反应。rcELF4蛋白定位在细胞核。【结论】 rcELF4蛋白在大肠杆菌中成功表达，且存在翻译后修饰现象，不同类型的免疫佐剂对rcELF4蛋白的免疫原性产生不同的影响，所制备rcELF4抗体免疫活性良好，且与人ELF4蛋白存在交叉反应。

来源：2022年第8期

《南方农业学报》期刊编辑部

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