南方农业学报

作者：陈曦, 杨金先, 李英英, 陈强, 黄小红, 宋铁英, 葛均青,

关键词：鳗鲡疱疹病毒 (AngHV), <i>ORF87</i>基因, 原核表达, 多克隆抗体, 免疫原性,

【目的】克隆鳗鲡疱疹病毒（Anguillid herpesvirus，AngHV） ORF87基因，分析其序列特征并制备多克隆抗体，为揭示ORF87基因在AngHV侵染过程中的作用机制提供技术支持。【方法】根据GenBank已公布AngHV参考株（NC_013668）的ORF87基因序列设计引物，从AngHV-FJ株基因组中扩增出ORF87基因，构建重组质粒pMD19-ORF87经酶切鉴定和测序验证后，采用Softberry、ProtParam、CDD、TMHMM、SignalP 5.0、PSORT及BepiPred等在线软件进行生物信息学分析；将ORF87基因克隆至pET-32a表达载体上，转化大肠杆菌BL21 （DE3）感受态细胞，经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测及Western blotting鉴定；以纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔，制备ORF87多克隆抗体。【结果】克隆获得的AngHV-FJ株ORF87基因为2127 bp，与GenBank已发布的参考序列高度同源（相似性为99.72%），仅存在4个碱基突变；其编码蛋白分子量为80.1 kD，理论等电点（pI）为7.62，不稳定系数为42.38，总平均亲水性为-0.271。ORF87蛋白具有蛋白激酶C超家族（PKC-like Superfamily）的保守结构域，但不具信号肽和跨膜结构域；其亚细胞定位可能位于细胞核和细胞质膜，存在19个潜在B细胞抗原表位，即具有良好的免疫原性。AngHV-FJ株ORF87基因可在大肠杆菌中高效表达，表达获得的融合蛋白约100.0 kD，主要以包涵体形式存在；以融合蛋白免疫新西兰大白兔制备获得的ORF87多克隆抗体效价达1：16000，能特异性识别AngHV的ORF87蛋白。【结论】 AngHV-FJ株源ORF87基因经原核表达载体诱导表达获得的融合蛋白ORF87具有Serine/threonine蛋白激酶活性，以其免疫新西兰大白兔制备获得的ORF87多克隆抗体具有高效价，能特异性识别AngHV感染，可作为亚细胞定位及表达时相分析等蛋白特性研究的工具，用于解析ORF87基因在AngHV侵染过程中的作用。

来源：2022年第2期

《南方农业学报》期刊编辑部

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