南方农业学报

作者：冯鹏霏, 肖蕊, 张永德, 林勇, 宋漫玲, 潘传燕, 余艳玲, 罗辉, 罗洪林,

关键词：斑马鱼, PTPRB, 原核表达, 多克隆抗体,

【目的】原核表达斑马鱼（Danio rerio）蛋白酪氨酸磷酸酶受体B（PTPRB）并制备多克隆抗体，为研究斑马鱼PTPRB基因功能及血管发育相关信号传导通路打下基础。【方法】采用无缝克隆技术将斑马鱼PTPRB基因插入原核表达载体pET-B2m构建重组表达质粒，转化大肠杆菌B21感受态细胞后采用IPTG进行诱导表达，然后以诱导表达的融合蛋白免疫大耳兔制备多克隆抗体，并采用Western blotting和ELISA检测多克隆抗体的特异性及免疫效价。【结果】斑马鱼PTPRB蛋白亲水性均值为-0.490，属于亲水性蛋白，且具有较丰富的潜在抗原表位位点，分布均匀，无典型的跨膜区。将斑马鱼PTPRB基因插入原核表达载体pET-B2m成功构建获得重组表达质粒pET-B2-PTPRB，转化B21感受态细胞后经IPTG诱导表达，即获得35.0 kD的融合蛋白。融合蛋白PTPRB主要以包涵体形式存在；以纯化融合蛋白PTPRB免疫大耳兔，其血清抗体效价为1∶2048000，说明采用融合蛋白PTPRB可有效刺激大耳兔产生较强的免疫反应，获得较高效价的PTPRB多克隆抗体。Western blotting检测结果显示，PTPRB多克隆抗体具良好抗原特异性。采用Protein A/G亲和层析柱对制备获得的PTPRB多克隆抗体进行亲和层析纯化，可获得高纯度的多克隆抗体，纯化后的PTPRB多克隆抗体浓度在10 mg/mL以上。【结论】构建的斑马鱼PTPRB基因原核表达载体能高效表达具备良好免疫原性的融合蛋白PTPRB，以融合蛋白PTPRB免疫大耳兔可获得高效价、高特异性的PTPRB多克隆抗体，为研究斑马鱼PTPRB蛋白功能提供有利工具，也为揭示PTPRB在鱼类血管发育中的作用机制提供技术支持。

来源：2021年第4期

《南方农业学报》期刊编辑部

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